FAT4過表達(dá)在宮頸癌中促進(jìn)抗腫瘤免疫的復(fù)雜機(jī)制——調(diào)節(jié)β-catenin/STT3/PD-L1軸

       FAT4（FAT非典型鈣粘蛋白4）是鈣粘蛋白相關(guān)蛋白家族的一員，已被證明通過抑制增殖和轉(zhuǎn)移而發(fā)揮腫瘤抑制作用。Wnt/β-catenin通路激活與PD - L1相關(guān)的腫瘤免疫逃逸高度相關(guān)。在這里，作者報告FAT4過表達(dá)通過β-catenin依賴的方式抑制PD-L1 N-糖基化和細(xì)胞膜定位來調(diào)節(jié)宮頸癌抗腫瘤免疫的機(jī)制。首次在宮頸癌組織和細(xì)胞系中檢測到FAT4的表達(dá)。通過細(xì)胞增殖、克隆形成和免疫熒光測定體外FAT4過表達(dá)對腫瘤的抑制作用，并在免疫缺陷和免疫完整小鼠異種移植物中證實這一發(fā)現(xiàn)。通過體內(nèi)和體外功能和機(jī)制實驗，作者研究FAT4過表達(dá)如何通過β-catenin/STT3/PD-L1軸影響抗腫瘤免疫。FAT4在宮頸癌組織和細(xì)胞系中下調(diào)。作者確定FAT4與β-catenin結(jié)合并拮抗其核定位，通過降解配合物（AXIN1，APC，GSK3β，CK1）促進(jìn)β-catenin的磷酸化和降解。FAT4過表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上降低程序性死亡配體1（PD-L1）mRNA的表達(dá)，并在翻譯后修飾（PTMs）水平上通過STT3A導(dǎo)致PD-L1異常糖基化，導(dǎo)致其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）積累和多泛素化依賴性降解。作者發(fā)現(xiàn)，在免疫反應(yīng)性小鼠模型中，F(xiàn)AT4過表達(dá)以β-catenin依賴的方式促進(jìn)PD-L1異常糖基化和降解，從而增加細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）活性。這些發(fā)現(xiàn)解決Wnt/β-catenin通路在宮頸癌中激活的基礎(chǔ)，并提供針對FAT4/β-catenin/STT3/PD-L1軸的聯(lián)合免疫治療方案。本文于2023年9月發(fā)表于《Journal of Experiment and Clinical Cancer Research》 IF:11.3期刊上。
技術(shù)路線

主要實驗結(jié)果
1、FAT4在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞中下調(diào)
       人類FAT4基因編碼4924-aa蛋白，具有細(xì)胞外34個Cadherin重復(fù)序列，4個EGF樣結(jié)構(gòu)域和2個層粘連蛋白G樣結(jié)構(gòu)域（圖1A）。使用cBioPortal在線工具對TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析并且FAT4在人類腫瘤，尤其是鱗狀細(xì)胞癌中經(jīng)常發(fā)生突變或缺失，這意味著FAT4失調(diào)是人類實體腫瘤中普遍存在的改變。對宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸內(nèi)腺癌（CESC）數(shù)據(jù)集的進(jìn)一步分析顯示，腫瘤樣本中的FAT4 mRNA水平顯著低于正常組織（圖1B）。隨后，在12組人宮頸癌組織和子宮頸癌周組織（PT）中檢測FAT4的表達(dá)，結(jié)果顯示，宮頸癌組織中的FAT4蛋白水平顯著低于癌周組織（圖1C）。為進(jìn)一步證實這些結(jié)果，作者對50例宮頸癌患者和20例正常宮頸標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在正常鱗狀上皮組織和癌旁組織中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中均可見較強(qiáng)的FAT4免疫信號（圖1D），而在宮頸癌組織中，F(xiàn)AT4低表達(dá)（78%對22%，圖1F）。根據(jù)免疫組化評分（IRS）將FAT4的表達(dá)分為低表達(dá)組（IRS≤3）和高表達(dá)組（IRS≥4）。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AT4低表達(dá)的宮頸癌患者預(yù)后較差（Logrank P=0.0036，圖1G）。本研究還研究FAT4表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，認(rèn)為低FAT4表達(dá)與侵襲性和轉(zhuǎn)移性特征有關(guān)，包括宮頸浸潤深度、淋巴血管浸潤和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

圖1 FAT4在宮頸癌中下調(diào)并與預(yù)后不良相關(guān)

2、FAT4過表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞和免疫缺陷小鼠的增殖
       已有研究表明FAT4可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但其在宮頸癌中的作用尚不清楚。利用免疫熒光和免疫印跡技術(shù)檢測6種宮頸癌細(xì)胞系中FAT4的表達(dá)，在ME180、C33A和U14細(xì)胞中FAT4的表達(dá)較低，在SiHa、Caski和Hela細(xì)胞中表達(dá)較高（圖1H），但在上述細(xì)胞系中均未觀察到FAT4的細(xì)胞膜定位（圖1I）。由于FAT4全長蛋白分子量為543 kDa，作者采用缺陷cas9協(xié)同激活介質(zhì)（dCas9-SAM）技術(shù)，利用短向?qū)NA （sgRNA）靶向FAT4啟動子區(qū)，反式作用ME180宮頸癌細(xì)胞系，內(nèi)源性促進(jìn)FAT4的表達(dá)。作為對照，轉(zhuǎn)染dCas9質(zhì)粒和非靶向sgRNA序列（CTRL）。同樣的方法促進(jìn)U14小鼠宮頸癌細(xì)胞系中FAT4的內(nèi)源性過表達(dá)（圖2A和B）。由于FAT4是調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附的鈣粘蛋白超家族的成員，免疫熒光證實細(xì)胞膜上FAT4的表達(dá)增加（圖2D），特別是在細(xì)胞與細(xì)胞接觸的部位，這與FAT原鈣粘蛋白家族對細(xì)胞間接觸的調(diào)節(jié)有關(guān)。在ME180和U14宮頸細(xì)胞系中，F(xiàn)AT4過表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖和集落形成效率，且具有時間依賴性（圖2C、E和F）。
       在體內(nèi)研究中，作者選擇sgFAT4單克?。?H1），并將ME180宮頸癌細(xì)胞接種到免疫缺陷（BALB/c裸）小鼠中。與雜亂陰性對照組（CTRL、Cas9質(zhì)粒和非靶向引導(dǎo)序列）相比，轉(zhuǎn)染sgFAT4組的腫瘤體積明顯減?。▓D2G和H）。此外，與CTRL組相比，sgFAT4組的生存時間更長（圖2I）。作者在小鼠宮頸癌細(xì)胞系U14上重復(fù)上述實驗，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FAT4可以抑制腫瘤生長（圖2J和K），延長小鼠生存期（圖2L）。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)AT4過表達(dá)抑制免疫缺陷小鼠的腫瘤增殖。

圖2 在體外和體內(nèi)，F(xiàn)AT4過表達(dá)均能抑制宮頸癌的增殖

3、在免疫能力小鼠中，F(xiàn)AT4增加CTL活性并改變腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的特征
       直觀地，免疫缺陷BALB/c裸鼠中FAT4過表達(dá)可減小腫瘤大小，延長生存期（圖2G-L）。然而，當(dāng)將sgFat4細(xì)胞注射到同基因小鼠（C57BL/6）中時，sgFat4組的腫瘤生長和存活差異比免疫缺陷小鼠更明顯。與CTRL組相比，注射后第3周左右，sgFat4組腫瘤體積明顯縮?。▓D3A和B），sgFat4組存活時間比CTRL組延長（圖3C）。此外，在注射sgFat4 U14細(xì)胞的同基因小鼠中，腫瘤生長緩慢。令人驚訝的是，注射后第四周左右，腫瘤從注射部位消退，表明FAT4過表達(dá)激活抗腫瘤免疫（圖3D）。接下來，作者用免疫熒光證實，sgFat4組中ki67陽性細(xì)胞的比例明顯低于CTRL組（圖3E）。
       為研究FAT4過表達(dá)激活抗腫瘤免疫的機(jī)制，作者在免疫正常的C57BL/6小鼠中構(gòu)建皮下移植腫瘤，并在腫瘤消退前收集腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步分析（局部注射后2周，圖3F）。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTLs）分泌高水平的穿孔素、顆粒酶B （GZMB）和干擾素-γ（IFN-γ），它們是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)物。作者使用免疫熒光技術(shù)評估GZMB的釋放，發(fā)現(xiàn)sgFat4組的GZMB⁺區(qū)域明顯多于CTRL組（圖3G - I）。由于GZMB在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后靶向caspase-3和裂解caspase誘導(dǎo)凋亡，作者比較裂解caspase-3（CCA3）的水平，在CTRL小鼠的腫瘤組織中只有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而在sgFat4小鼠中廣泛觀察到強(qiáng)烈的凋亡聚集信號（圖3J和K）。
       熒光活化細(xì)胞分選（FACS）顯示，在sgFat4組中CD8⁺的比例更高（圖4 A和B），CD8⁺CTL活性（CD8⁺ GZMB⁺和CD⁺ IFN-γ⁺）群體顯著更高（圖4 A和D）。同樣地，作者發(fā)現(xiàn)CD4⁺CTL釋放GZMB和IFN-γ水平相當(dāng)高（圖4 C和E）。由于癌細(xì)胞通過免疫檢查點抑制CTL活性，作者繼續(xù)研究FAT4過表達(dá)是否改善PD - L1介導(dǎo)的免疫逃逸。免疫熒光顯示，在sgFat4組中，PD-L1的膜定位明顯降低（圖4F和G）。免疫組化（IHC）也支持上述發(fā)現(xiàn)，顯示sgFat4組中CCA3蛋白水平顯著升高，PD-L1蛋白水平顯著降低（圖4H和I）。實時定量PCR （RT-qPCR）證實，Cd274 mRNA水平在sgFat4組中較低（圖4J）。PD-L1表達(dá)降低與活化腫瘤浸潤C(jī)D8⁺ T細(xì)胞顯著增加相關(guān)。在本節(jié)中，作者證明FAT4過表達(dá)阻止免疫缺陷小鼠的腫瘤進(jìn)展，增加CTL活性，甚至促進(jìn)C57BL/6免疫活性小鼠的腫瘤退化，這表明完整的免疫系統(tǒng)增強(qiáng)FAT4過表達(dá)的抗腫瘤效果。

圖3 體內(nèi)FAT4過表達(dá)促進(jìn)抗腫瘤免疫

圖4 在免疫反應(yīng)小鼠模型中，F(xiàn)AT4過表達(dá)激活CTL并抑制PD-L1表達(dá)

4、FAT4結(jié)合β -catenin并促進(jìn)其在宮頸癌細(xì)胞中的降解
       為確定FAT4介導(dǎo)的腫瘤抑制的下游信號通路，作者對C33A和ME180人宮頸癌細(xì)胞系的sgFAT4和非靶向sgRNA序列（CTRL）進(jìn)行RNA測序。根據(jù)KGEE富集分析，差異改變主要包括淋巴細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)粘附途徑、N-聚糖生物合成和淋巴細(xì)胞受體途徑（圖5A）。有證據(jù)表明，F(xiàn)AT4同源物原鈣粘蛋白家族FAT1在內(nèi)皮損傷修復(fù)和人腫瘤細(xì)胞中與β-catenin結(jié)合。但FAT4和β-catenin之間是否存在這種相互作用尚不清楚。作者首先證實在ME180（圖5B）中，F(xiàn)AT4過表達(dá)與細(xì)胞膜上的β-catenin結(jié)合。通過共免疫沉淀證實內(nèi)源性FAT4在ME180和U14宮頸癌細(xì)胞中與β-catenin結(jié)合（圖5C）。
       降解復(fù)合物（AXIN，GSK3β，CK1α，APC）介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的磷酸化，促進(jìn)其泛素化和隨后的蛋白酶體降解。通過免疫沉淀，作者發(fā)現(xiàn)FAT4過表達(dá)組與CTRL組相比，降解復(fù)合物與β-catenin的結(jié)合明顯增強(qiáng)（圖5D）。類似地，活性β-catenin的表達(dá)顯著降低，這對于β-catenin通過典型Wnt信號介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要。相應(yīng)地，總β-catenin、磷酸化依賴性GSK3β穩(wěn)定以及Wnt靶基因MMP9、C-Myc和cyclin D1的表達(dá)均被顯著抑制（圖5E）。由于β-catenin的核定位明顯減少，作者使用TOPFlash/FOPFlash熒光素酶報告基因法評估β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，在sgFAT4組中，β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄明顯減少（圖5F）。這些發(fā)現(xiàn)在C57BL/6免疫反應(yīng)性小鼠移植腫瘤中也得到證實，其中免疫組織化學(xué)染色顯示細(xì)胞核中活性β-catenin陽性信號顯著減少，同時總β-catenin染色減少（圖5G和H）。這些數(shù)據(jù)表明FAT4作為Wnt/β-catenin信號的抑制因子，在細(xì)胞膜上“捕獲”β-catenin并促進(jìn)其降解。

圖5 FAT4過表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路

5、FAT4過表達(dá)抑制PD?L1表達(dá)和細(xì)胞膜定位
       Wnt/β-catenin通路被異常激活，促進(jìn)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，同時促進(jìn)免疫檢查點PD-L1的表達(dá)和細(xì)胞膜定位，導(dǎo)致T細(xì)胞最終衰竭，失去關(guān)鍵功能。具體來說，β-catenin穿梭到細(xì)胞核，促進(jìn)CD274和N糖基轉(zhuǎn)移酶STT3的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)PD-L1糖基化和ER-高爾基轉(zhuǎn)運和成熟。
最近的研究表明，PD-L1在腫瘤細(xì)胞的膜上高度糖基化，并且PD-L1的N-糖基化，免疫印跡上的分子量約為45 kDa，這對于通過阻斷PD-L1的泛素/蛋白酶體介導(dǎo)的破壞來穩(wěn)定PD-L1蛋白至關(guān)重要。作者發(fā)現(xiàn)FAT4過表達(dá)降低N-糖基化PD-L1（45 kDa，黑點），而增加非糖基化PD-L1（33 kDa，黑色箭頭，圖6A）?；隗w內(nèi)實驗結(jié)果，作者同樣發(fā)現(xiàn)FAT4過表達(dá)在蛋白和mRNA水平上顯著降低STT3A和PD-L1的表達(dá)（圖6A、C和D）。
       由于PD-L1的活性形式定位于細(xì)胞膜上，作者試圖證明FAT4如何影響PD-L1的亞細(xì)胞定位。免疫熒光證實CTRL PD-L1主要位于細(xì)胞膜上（圖6B，白色箭頭），相反，sgFAT4 PD-L1信號在細(xì)胞質(zhì)檢測到（圖6B，紅色箭頭），膜上信號減少。流式細(xì)胞術(shù)顯示，F(xiàn)AT4過表達(dá)顯著降低PD-L1細(xì)胞膜表達(dá)（圖6E）。作者進(jìn)一步研究FAT4過表達(dá)在體外以β-catenin依賴的方式降低PD-L1的表達(dá)。組成型活性β-catenin突變體(active β-catenin)的表達(dá)[28]增加PD-L1總蛋白表達(dá)和CD274 mRNA表達(dá)(圖6F和G)，促進(jìn)PD-L1糖基化成熟(45 kDa，圖6F)。值得注意的是，活躍的β-catenin表達(dá)消除FAT4過表達(dá)對CD274 mRNA的抑制作用（圖6G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)AT4誘導(dǎo)的β-catenin失活導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中PD-L1的下調(diào)。在功能上，作者證明細(xì)胞膜上PD-L1表達(dá)的減少導(dǎo)致PD-1結(jié)合的顯著減少（圖6H和I）。總的來說，這些結(jié)果表明，F(xiàn)AT4過表達(dá)以β-catenin依賴的方式降低癌細(xì)胞中PD-L1的水平。

圖6 FAT4過表達(dá)抑制PD-L1表達(dá)和細(xì)胞膜定位

6、FAT4過表達(dá)誘導(dǎo)PD - L1異常糖基化并阻止其ER-to-Golgi易位
       內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）管腔在細(xì)胞內(nèi)運輸過程中膜糖蛋白的特殊糖基化與高爾基轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。糖基化的PD-L1增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)的半衰期比未糖基化的PD-L1至少長4倍。接下來，作者進(jìn)行半衰期分析，正如預(yù)期的那樣，PD-L1的半衰期在FAT4過表達(dá)的細(xì)胞中縮短（圖7A）。PD-L1與高爾基標(biāo)記物（TGN38）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物（Calregulin，CALR）共染色顯示，CTRL而非sgFAT4 PD-L1 與高爾基標(biāo)記物共定位，sgFAT4而非CTRL PD-L1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物共定位（圖7B和C）。這表明FAT4阻斷PD-L1的ER-高爾基轉(zhuǎn)運，從而誘導(dǎo)PD-L1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累。寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（OST）催化亞基STT3是PD-L1糖基化和蛋白質(zhì)穩(wěn)定所必需的，而β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2結(jié)合是誘導(dǎo)STT3A/B轉(zhuǎn)錄所必需的。糖基化穩(wěn)定PD-L1并保護(hù)PD-L1免受GSK3Β介導(dǎo)的26S蛋白酶體依賴性泛素化降解。正如預(yù)期的那樣，在FAT4過表達(dá)細(xì)胞中，內(nèi)源性PD-L1泛素化顯著增加（圖7D）。作者發(fā)現(xiàn)FAT4過表達(dá)降低STT3A-PD-L1相互作用，同時增加GSK3β-PD-L1相互作用，表明FAT4以β-catenin依賴的方式抑制PD-L1的起始糖基化（圖7E）。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)AT4導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中非糖基化的PD-L1經(jīng)歷GSK3 Β介導(dǎo)的蛋白酶體泛素化降解。

圖7 FAT4過表達(dá)誘導(dǎo)PD-L1異常糖基化并阻止其ER-to-Golgi易位

結(jié)論
       在本研究中，作者證明FAT4過表達(dá)以β-catenin依賴的方式抑制PD-L1轉(zhuǎn)錄和進(jìn)一步的糖基化修飾。RNA-seq數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)AT4調(diào)控N -聚糖的生物合成。具體來說，F(xiàn)AT4可以通過ER相關(guān)的N -糖基轉(zhuǎn)移酶STT3A引起PD-L1的異常N -鏈糖基化和ER保留，阻止PD-L1轉(zhuǎn)運到膜上。作者證實FAT4能夠促進(jìn)GSK3β與PD-L1的相互作用和進(jìn)一步的泛素化依賴性降解。功能上，通過T細(xì)胞介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷實驗和PD-L1/PD-1結(jié)合實驗，作者證明FAT4在腫瘤細(xì)胞中的過表達(dá)通過下調(diào)PD-L1水平顯著激活CTL活性。因此，這項研究揭示腫瘤PD-L1調(diào)控的分子機(jī)制。最后，作者在宮頸癌中發(fā)現(xiàn)一個新的FAT4蛋白表達(dá)譜，并表明FAT4調(diào)節(jié)免疫編輯，這表明FAT4/β-catenin/STT3/PD-L1信號軸可能是宮頸癌的潛在靶點。

實驗方法
生物信息學(xué)分析；細(xì)胞培養(yǎng)；FAT4過表達(dá)細(xì)胞系的建立；CTL譜的FACS分析；免疫熒光；蛋白提取；WB；共免疫沉淀；T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷試驗；PD-1和PD-L1結(jié)合試驗；免疫組化；Kaplan - Meier生存分析；RNA分離和qRT - PCR；細(xì)胞增殖和集落形成；細(xì)胞增殖試驗；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性測定。
參考文獻(xiàn)
Wang D, Wu S, He J, Sun L, Zhu H, Zhang Y, Liu S, Duan X, Wang Y, Xu T. FAT4 overexpression promotes antitumor immunity by regulating the β-catenin/STT3/PD-L1 axis in cervical cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Sep 1;42(1):222. doi: 10.1186/s13046-023-02758-2.

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