新發(fā)現(xiàn)！GAP43依賴性線粒體轉(zhuǎn)移增強GBM致瘤性！

       完整線粒體在異質(zhì)細胞類型之間的轉(zhuǎn)移已在包括癌癥在內(nèi)的各種環(huán)境中得到證實。然而，線粒體轉(zhuǎn)移對腫瘤生物學的功能意義知之甚少。在這里，作者表明線粒體轉(zhuǎn)移是膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）中普遍存在的現(xiàn)象，這是最常見和惡性的原發(fā)性腦腫瘤。該研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞的水平線粒體轉(zhuǎn)移是增強GBM腫瘤發(fā)生的機制。這是由參與神經(jīng)元軸突再生和星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性的蛋白質(zhì)生長相關(guān)蛋白43（GAP43）促進的。星形膠質(zhì)細胞線粒體的獲得推動線粒體呼吸的增加與增殖和與致瘤性相關(guān)的代謝途徑的上調(diào)。在功能上，星形膠質(zhì)細胞線粒體的攝取促進細胞周期進展到增殖性G2/M期，并增強GBM的自我更新和致瘤性?？偟膩碚f，研究結(jié)果揭示宿主-腫瘤相互作用，推動癌細胞的增殖和自我更新，為治療開發(fā)提供機會。本文于2023年5月發(fā)表在《Nature cancer》IF：22.7期刊上。
技術(shù)路線

主要實驗結(jié)果
1、GBM從微環(huán)境中獲取線粒體
       為評估非惡性宿主細胞是否可以在體內(nèi)將線粒體轉(zhuǎn)移到GBM中，該研究將表達綠色熒光蛋白（GFP）的同基因小鼠GBM模型（SB28和GL261）原位植入表達與定位肽融合的線粒體定位的mKate2熒光基團的轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠8（mito::mkate2小鼠;圖1a）。來自mito::mKate2小鼠的GBM腫瘤的共聚焦顯微鏡顯示在15-60%的GFP GBM細胞內(nèi)的mKate2⁺斑點（圖1b-f），表明宿主細胞線粒體是通過原位GBM腫瘤細胞在體內(nèi)獲得的。為確定線粒體轉(zhuǎn)移是否發(fā)生在人體內(nèi)GBM的情況下，作者首先將高滴度mitoDsRed慢病毒注射到裸鼠的大腦中，以用線粒體熒光標簽轉(zhuǎn)導正常腦細胞。7天后，在同一位置注射P3 GFP⁺人源性GBM干細胞（GSCs）（圖1g）。高分辨率共聚焦圖像證實線粒體從基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞，支持小鼠體內(nèi)數(shù)據(jù)（圖1g）。當三維重建時，在GFP陽性的受體細胞中存在mitoDsRed信號。

圖1 GBM細胞從TME獲得宿主線粒體

       為進一步闡明主要線粒體供體細胞群的身份，作者將流行的腫瘤浸潤細胞類型與GFP⁺ GBM細胞以1：2的供體：受體比例共培養(yǎng)。2小時后評估m(xù)Kate2⁺細胞作為線粒體轉(zhuǎn)移標志物的百分比（圖2a）。與體內(nèi)觀察一致，作者發(fā)現(xiàn)腦駐留的神經(jīng)膠質(zhì)細胞（星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞）在每個細胞的基礎(chǔ)上貢獻的線粒體明顯多于骨髓來源的巨噬細胞，星形膠質(zhì)細胞具有更高的轉(zhuǎn)移率（圖2b）。雖然巨噬細胞進一步極化為M2或M1表型可能有利于增加線粒體轉(zhuǎn)移，但平均而言，轉(zhuǎn)移程度比體外腦駐留神經(jīng)膠質(zhì)細胞觀察到的程度低五到十倍。
       鑒于以前的觀察，星形膠質(zhì)細胞顯示出高速率的線粒體轉(zhuǎn)移到GBM小鼠模型，以及它們先前描述的在體內(nèi)與GBM的相關(guān)性，作者將后續(xù)研究重點放在該神經(jīng)膠質(zhì)細胞群上。首先將mito-mCherry或mitoDsRed永生化的人星形膠質(zhì)細胞與六種不同的人源性GSC（L1，DI318，3832，GG16，P3和BG5）共培養(yǎng)3-4天，以探究其發(fā)現(xiàn)在人類疾病模型中的適用性。與小鼠GBM模型一樣，作者發(fā)現(xiàn)人類來源的GSC從星形膠質(zhì)細胞中獲得線粒體，流式細胞術(shù)顯示轉(zhuǎn)移率為5-40%（圖2c，d）。接著通過GSC的共聚焦顯微鏡證實星形膠質(zhì)細胞線粒體的內(nèi)化，其中熒光蛋白標記的線粒體完全在GSCs內(nèi)可視化，細胞質(zhì)預(yù)先用CellTrace染料標記或表達GFP。使用圖1g得出的人原位GBM模型（P3）確認星形膠質(zhì)細胞到人GBM的線粒體轉(zhuǎn)移在體內(nèi)是相關(guān)的。作者通過鑒定mitoDsRed⁺星形膠質(zhì)細胞（神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP⁺）和GFP^–）周圍GFP GBM細胞與轉(zhuǎn)移的mitoDsRed⁺線粒體（圖2e）。最后，通過共定位分析證實，用mito-mCherry標記的轉(zhuǎn)移線粒體表達線粒體外膜20（TOMM20）的線粒體蛋白易位子，并且該蛋白分布在接收GBM細胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)中?？傊髡哂^察到線粒體在體內(nèi)和體外從TME轉(zhuǎn)移到GBM，并確定星形膠質(zhì)細胞是主要的線粒體供體。

圖2 GBM細胞從星形膠質(zhì)細胞中獲取線粒體

2、GAP43⁺ MTs促進線粒體轉(zhuǎn)移
       作者認為線粒體轉(zhuǎn)移可以通過分泌和/或細胞接觸進行。為區(qū)分這兩種機制，將共培養(yǎng)物的線粒體轉(zhuǎn)移率與轉(zhuǎn)移的供體條件培養(yǎng)基的線粒體轉(zhuǎn)移率進行比較（小鼠模型）或由5 μm多孔Transwell插入物隔開的細胞（人體模型；圖3a）。無論采用何種分離方法，轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在供體和受體細胞物理接觸時，并且只有低水平的分泌物轉(zhuǎn)移接近測定的檢測限。表明這是一個主動的、依賴于能量的過程，而不是一個被動的事件。綜上所述，這些結(jié)果表明，有效線粒體轉(zhuǎn)移需要腫瘤和供體細胞的主動物理相互作用，這與體內(nèi)腦腫瘤模型的成像一致（圖1和2）。
       MTs是GBM中細胞間通訊和網(wǎng)絡(luò)形成的既定渠道，因此也是線粒體轉(zhuǎn)移的潛在介質(zhì)。為可視化GBM細胞界面內(nèi)的線粒體，作者對TOMM20和肌動蛋白的共培養(yǎng)免疫染色進行共聚焦顯微鏡檢查。除核周定位外，在腫瘤細胞之間的MT連接中還發(fā)現(xiàn)線粒體（P3模型；圖3b），與先前的研究報告一致，即線粒體成分在體外定位在星形膠質(zhì)細胞和GBM細胞連接之間。它們的管內(nèi)位置由z堆棧確認。重要的是，用肌動蛋白免疫染色的mitoDsRed⁺星形膠質(zhì)細胞和GFP⁺ P3共培養(yǎng)物的共聚焦顯微鏡顯示MTs與mitoDsRed⁺線粒體連接兩種細胞類型。這些存在于轉(zhuǎn)移的線粒體附近（圖3c）。同時還發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞mitoDsRed⁺供體線粒體在連接的腫瘤受體細胞之間穿梭，表明星形膠質(zhì)細胞線粒體可以在腫瘤-腫瘤連接的完整網(wǎng)絡(luò)中進一步交換（圖3c）。在可視化線粒體沿著含有肌動蛋白絲的細胞間連接運輸后，作者假設(shè)肌動蛋白細胞骨架在促進線粒體轉(zhuǎn)移方面至關(guān)重要。事實上，細胞松弛素B抑制肌動蛋白聚合導致轉(zhuǎn)移速率顯著降低，而不影響細胞活力。相比之下，用長春新堿抑制微管蛋白聚合對線粒體轉(zhuǎn)移沒有影響（圖3d）。

圖3 星形膠質(zhì)細胞通過基于肌動蛋白的細胞間連接將線粒體轉(zhuǎn)移到GBM

       先前的工作表明，GAP43促進GBM細胞在體內(nèi)相互連接網(wǎng)絡(luò)的形成，這使得連接蛋白43介導的鈣波傳播成為可能。GAP43是一種肌動蛋白相關(guān)蛋白，可通過生長錐促進神經(jīng)突生長。作者設(shè)想GAP43也定位于共培養(yǎng)中GBM細胞和星形膠質(zhì)細胞的細胞投影（圖4a）。當敲低GAP43在人源性GSC中的表達時，觀察到細胞投影的數(shù)量減少（圖4b，c）。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)當GAP43在單獨的GSC中或同時在GSC和星形膠質(zhì)細胞中被敲低時，來自星形膠質(zhì)細胞的線粒體轉(zhuǎn)移顯著減少（圖4d，e）。這些數(shù)據(jù)表明GAP43在促進線粒體從星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)移到GBM中起作用。

圖4 GAP43通過腫瘤-星形膠質(zhì)細胞MTs促進線粒體轉(zhuǎn)移

3、星形膠質(zhì)細胞線粒體代謝重編程GBM細胞
       假設(shè)從星形膠質(zhì)細胞接收整個細胞器將在受體GBM細胞中具有生物學上重要的下游功能后遺癥。作者通過對從共培養(yǎng)物中獲得（mKate2⁺）或沒有（mKate2^?）星形膠質(zhì)細胞線粒體的分選小鼠GBM細胞進行批量RNA測序（RNA-seq），探究線粒體轉(zhuǎn)移如何在轉(zhuǎn)錄上影響細胞。RNA-seq顯示共培養(yǎng)細胞中上調(diào)基因在與線粒體生物學相關(guān)的電子傳輸和線粒體組織途徑中富集。
       鑒于線粒體在ATP產(chǎn)生中的核心作用以及RNA-seq分析結(jié)果，作者探究功能性線粒體通過轉(zhuǎn)移的增加是否會導致代謝參數(shù)的可測量變化，特別是耗氧率。接著對GFP⁺受體細胞（P3模型）進行線粒體應(yīng)激測試，與使用海馬系統(tǒng)的相同共培養(yǎng)物的對照細胞相比，來自mitoDsRed⁺星形膠質(zhì)細胞的線粒體高和低轉(zhuǎn)移。測量基礎(chǔ)呼吸速率后，作者依次添加電子傳遞鏈抑制劑以評估最大呼吸能力的變化。有趣的是，基礎(chǔ)呼吸和最大呼吸速率均根據(jù)線粒體轉(zhuǎn)移而增加（圖5a-c）。當根據(jù)基礎(chǔ)呼吸和糖酵解速率將細胞分成代謝亞組時，線粒體轉(zhuǎn)移量最高的細胞比轉(zhuǎn)移量較低的細胞和對照細胞更有氧、更有活力（圖5d）。通過調(diào)整先前報道的代謝流式細胞術(shù)組合，作者進一步表征一組GSCs在與人星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)后的代謝譜。線粒體ATP合酶亞基ATP5A是受體GSCs中最一致的上調(diào)代謝蛋白之一（圖5e）和GBM的小鼠模型。接下來評估這些具有較高呼吸能力和ATP合酶水平的細胞是否產(chǎn)生更多的ATP。在多個人類來源的GBM模型中，作者通過發(fā)光報告測定法測量得到從星形膠質(zhì)細胞獲得線粒體的GBM細胞也具有更高水平的ATP（圖5f，g）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)移的星形膠質(zhì)細胞線粒體具有生物活性，并導致受體GBM細胞中線粒體呼吸和ATP產(chǎn)生增強。

圖5 星形膠質(zhì)細胞線粒體的獲得通過受體GBM細胞中的線粒體呼吸增強ATP的產(chǎn)生

       線粒體可以通過調(diào)節(jié)不同的代謝途徑進一步影響細胞生物學，并且越來越多的證據(jù)表明它們會影響細胞內(nèi)磷酸化信號級聯(lián)反應(yīng)。因此，作者對來自與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的分選GBM細胞進行代謝物質(zhì)譜測定和584位點蛋白質(zhì)磷酸化陣列，以詢問線粒體攝取的功能后果。代謝物富集分析顯示，GL2和SB261小鼠模型共享的mKate2⁺ GBM細胞中存在多種上調(diào)的代謝途徑（圖6a）。這些途徑包括氨基酸和核苷酸代謝，以前與GBM的增殖，自我更新和致瘤性有關(guān)。對分選的人源性L1細胞的代謝組學分析表明，mCherry⁺細胞的谷氨酸、α-酮戊二酸、谷胱甘肽和必需氨基酸的含量高于mCherry^?細胞（圖6b）。谷氨酸是谷胱甘肽中的三種氨基酸之一，谷胱甘肽是一種主要的細胞抗氧化劑，谷氨酸代謝是新生核苷酸合成中氮同化的主要途徑，可促進膠質(zhì)瘤中的許多致癌過程。這表明線粒體的轉(zhuǎn)移可能有助于GBM細胞支持增殖并防止氧化應(yīng)激。磷蛋白陣列揭示接受星形膠質(zhì)細胞線粒體的人源GSCs中許多信號蛋白和效應(yīng)蛋白磷酸化水平的變化，其中許多映射到增殖和細胞周期途徑（圖6c）。這些發(fā)現(xiàn)與受體細胞在線粒體呼吸增加之外的代謝重編程以及對細胞周期調(diào)節(jié)和其他過程具有潛在影響的細胞內(nèi)信號傳導一致。

圖6 星形膠質(zhì)細胞的線粒體轉(zhuǎn)移重新編程GBM代謝

4、線粒體轉(zhuǎn)移增加GBM致瘤性
       為確定在獲得星形膠質(zhì)細胞線粒體的GBM細胞中觀察到的代謝和信號變化是否導致細胞周期調(diào)節(jié)的改變，作者通過DNA染色和流式細胞術(shù)在多種人源GSC模型中對線粒體轉(zhuǎn)移模型進行細胞周期分析，觀察到在獲得星形膠質(zhì)細胞線粒體后，細胞周期增殖G2/M期的細胞比例持續(xù)增加（圖7a，b）。當分析mytho:: mKate2小鼠原位腫瘤的小鼠GBM模型時，這一觀察結(jié)果在體內(nèi)是一致的（圖7c，d）。此外，源自獲得星形膠質(zhì)細胞線粒體的分選細胞的原位小鼠GBM腫瘤具有更高的有絲分裂指數(shù)，表明增加的增殖表型在體內(nèi)保留。先前的報道表明，GSC可以吸收添加到細胞培養(yǎng)基中的分離的無細胞線粒體。將星形膠質(zhì)細胞衍生的線粒體添加到人衍生的GSC中足以概括細胞周期G2/M期細胞比例增加的情況（圖7e–g）。這些數(shù)據(jù)表明星形膠質(zhì)細胞線粒體的轉(zhuǎn)移影響人類GBM模型中的細胞周期調(diào)節(jié)。
       為進一步評估線粒體獲取對自我更新的影響，作者使用含有和不含有星形膠質(zhì)細胞線粒體的分選GBM細胞進行限制性稀釋球體形成測定。發(fā)現(xiàn)在人類和小鼠GBM模型中，獲得星形膠質(zhì)細胞線粒體的細胞具有顯著更高的自我更新能力，表現(xiàn)為更高的估計干細胞頻率（圖7h）。雖然人類來源的GSC模型表達高水平的多能性轉(zhuǎn)錄因子SOX2，但隨后發(fā)現(xiàn)獲得星形膠質(zhì)細胞線粒體的GSC進一步上調(diào)另一種自我更新的轉(zhuǎn)錄因子OCT4。這些發(fā)現(xiàn)表明，星形膠質(zhì)細胞的線粒體轉(zhuǎn)移由先前未描述的TME相互作用組成，該相互作用促進GBM自我更新。
       增殖能力和自我更新的增加是癌癥的核心標志；因此，作者假設(shè)星形膠質(zhì)細胞的線粒體轉(zhuǎn)移促進GBM的致瘤性。通過評估人源性GBM細胞的致死率（死亡時間或人道終點）和腫瘤起始能力來測試這一假設(shè)，這些細胞有或沒有通過原位植入免疫功能低下的小鼠獲得人星形膠質(zhì)細胞線粒體。這些研究表明，當起源于從星形膠質(zhì)細胞獲得線粒體并且體內(nèi)腫瘤起始能力顯著更高的GSCs時，腫瘤導致癥狀或致命疾病的速度要快得多（圖7i，j）。這一觀察結(jié)果在小鼠GBM模型中相似。因此，除在體外改變GBM細胞的表型外，星形膠質(zhì)細胞的線粒體轉(zhuǎn)移增加動物模型中這些細胞的體內(nèi)致瘤性。
       綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞線粒體可以以GAP43依賴性方式水平轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)母細胞瘤細胞，導致線粒體呼吸和代謝的變化，從而促進增殖和腫瘤生長。確定TME的線粒體轉(zhuǎn)移是GBM的基本促腫瘤生成機制。研究核心發(fā)現(xiàn)是從TME的非惡性細胞轉(zhuǎn)移線粒體促進了高度致瘤的細胞表型，其特征是增殖能力增加和自我更新（圖7k）。這表現(xiàn)為原位腫瘤在體內(nèi)具有更高的外顯率和更快的致死率。研究結(jié)果表明，顱內(nèi)腫瘤植入前星形膠質(zhì)細胞線粒體獲得驅(qū)動的增殖和自我更新增加的表型足以導致致瘤性增加，而在實驗性腫瘤起始時缺乏這種表型會導致GBM細胞增殖降低。因此，線粒體轉(zhuǎn)移和向氧化代謝的轉(zhuǎn)變包括GBM與其微環(huán)境的基本促腫瘤相互作用。研究為這一研究不足的過程增加了機制上的理解，為未來的研究奠定了基礎(chǔ)，這也可能廣泛適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的腫瘤和其他病理背景。

圖7 星形膠質(zhì)細胞的線粒體轉(zhuǎn)移驅(qū)動GBM細胞增殖，自我更新和致瘤性

實驗方法
慢病毒轉(zhuǎn)導，流式細胞術(shù)，裸鼠原位異種移植物模型，免疫熒光，體外小鼠線粒體轉(zhuǎn)移試驗，小鼠巨噬細胞的產(chǎn)生和體外線粒體攝取測定，WB，ATP定量，代謝組學分析，磷蛋白陣列，RNA-seq，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和網(wǎng)絡(luò)可視化，線粒體分離
參考文獻
Watson D C, Bayik D, Storevik S, et al. GAP43-dependent mitochondria transfer from astrocytes enhances glioblastoma tumorigenicity. Nat Cancer. 2023; 4(5): 648-664. doi: 10.1038/s43018-023-00556-5