tRF-Gln-CTG-026減少全局蛋白合成以改善肝損傷

       tRNA來源的小RNA（tsRNAs）是壓力應(yīng)激的產(chǎn)物，對應(yīng)激反應(yīng)和損傷調(diào)節(jié)有相當大的影響。然而，tsRNAs是否可以改善肝損傷仍不清楚。在這里，本研究證實tsRNA可改善肝損傷通過利用NSun2的缺失作為tsRNAs發(fā)生模型。機制上，NSun2的缺失降低了tRNAs的m⁵U修飾和m⁵C修飾，導(dǎo)致產(chǎn)生大量的tsRNAs，特別是tRF-1s類。通過進一步篩選，作者發(fā)現(xiàn)tRF-Gln-CTG-026（tG026）是最佳的tRF-1，它通過削弱TSR1（pre-rRNA加工蛋白TSR1同源物）與pre-40S核糖體之間的關(guān)聯(lián)，抑制全局蛋白合成，從而改善肝損傷。本文于2023年4月發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》IF:39.3期刊上。
技術(shù)路線

主要實驗結(jié)果
1、在體外構(gòu)建loss-of-NSun2作為tsRNA發(fā)生模型以緩解損傷
       首先對小鼠進行肝損傷誘導(dǎo)，驗證tsRNAs是否參與肝損傷和修復(fù)（圖1a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝損傷小鼠中tsRNA的數(shù)量增加（圖1b），表明tsRNA的產(chǎn)生與肝損傷有關(guān)。為進一步研究tsRNA與肝損傷的關(guān)系，建立tsRNA生成模型。通過篩選HL-7702細胞系中的三種tRNA修飾酶（NSun2、Mettl1和Dnmt2），在低損傷脅迫下，與ME-KD（Mettl1敲低）和DN-KD（Dnmt2敲低）相比，NSun2敲低（NS-KD）可導(dǎo)致增殖增加（圖1c, e）；此外，在高（致死）應(yīng)激下，NSun2敲低可提高細胞存活率（圖1d, e）。NS-KD也增加了H₂O₂處理下的細胞增殖（圖1f）。相反，使用不同的高強度應(yīng)激誘導(dǎo)劑（CCl4、對乙酰氨基酚和油酸混合物）并測量細胞存活率。結(jié)果顯示，NS-KD提高了應(yīng)激損傷下的細胞存活率(圖1g, i)。正如預(yù)期的，NS-KD僅在壓力下起作用，在基礎(chǔ)條件下，NS-KD不影響細胞增殖（圖1h, i）。總之，這些結(jié)果表明，肝損傷與tsRNA的產(chǎn)生有關(guān)，NS-KD可促進細胞增殖和存活，但不會改變體外壓力下的細胞遷移。

圖1 NS-KD改善細胞損傷。

2、NS-KD在體內(nèi)改善肝損傷
       如上所述，NSun2的缺失是研究tsRNAs的一個合適模型，可以改善細胞在應(yīng)激下的增殖和存活。因此，作者通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的NSun2基因第2外顯子56 bp的缺失，產(chǎn)生了NS-KO小鼠（圖2a）。在沒有應(yīng)激損傷的情況下，NS-KO沒有引起肝臟形態(tài)學(xué)和病理生理的異常（圖2b），這表明NS-KO和由此產(chǎn)生的tsRNAs在沒有應(yīng)激的情況下都沒有功能。通過腹腔注射(i.p) CCl4模擬短期或長期肝損傷（圖2c），證明NS-KO對應(yīng)激損傷和肝損傷有反應(yīng)。單次注射CCl4后第3天，肝臟出現(xiàn)壞死和炎癥；第27天，觀察到纖維化；NS-KO小鼠的壞死程度低于野生型小鼠（圖2d）。隨后檢測了單次或多次注射CCl4后的血液生化指標。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）濃度在單次注射CCl4后第3天達到最大值，表明肝細胞損傷相當嚴重，隨后在重復(fù)注射CCl4后第27天降至相對正常水平；NS-KO小鼠的3項指標均低于WT小鼠，提示NS-KO小鼠肝損傷輕微（圖2e, f）。此外，與WT小鼠相比，NS-KO小鼠在肝損傷第3天增殖肝細胞數(shù)量明顯增加（圖2g）；相反，NS-KO小鼠的干細胞凋亡顯著下降（圖2h）。在應(yīng)激狀態(tài)下，促增殖、促生存和抗炎相關(guān)基因的表達增加，而抗增殖、抗生存和抗炎相關(guān)基因的表達受到抑制（圖2i）。總之，在短期和長期肝損傷中，觀察到NS-KO小鼠的肝損傷比WT小鼠輕，表明NSun2缺失可減輕體內(nèi)肝損傷。

圖2 NS-KO改善肝壞死、再生和活體存活

3、NS-KO衍生的小RNA可改善應(yīng)激下的增殖和存活
       作者假設(shè)，NS-KO可通過NS-KO衍生的小RNA防止肝損傷。為驗證這一假設(shè)，首先敲除HL-7702細胞系中的NSun2，將沒有酶活性的突變體NSun2（K190M或C271A）轉(zhuǎn)染到HL-7702細胞系中，并細胞毒性刺激。EdU和細胞增殖實驗表明，只有WT NSun2能抑制NSun2敲除引起的細胞增殖促進（圖3a、b、d），而NSun2突變體（K190M或C271A）不能。同樣，只有WT NSun2 能逆轉(zhuǎn)NS-KD引起的細胞活力增加，而NSun2突變體則不能（圖3c, d）。這些結(jié)果表明，NSun2的缺失主要通過tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的喪失來促進細胞在脅迫下的增殖和存活。在NS-KO細胞中，tRNA表達降低(圖3e)。變異最顯著的修飾是tRNA m5U和之前描述的m5C，在NS-KO樣本中，兩者都顯著降低（圖3f, g）。
       上述發(fā)現(xiàn)表明，NS-KO通過失去其甲基轉(zhuǎn)移酶活性，同時減少tRNA m5U和m5C修飾來發(fā)揮作用。隨后研究NS-KO衍生的小RNA是否足以改善細胞在壓力下的增殖和存活。從WT和NS-KO小鼠體內(nèi)分離出14-50 nt和50-100 nt的肝臟RNA片段（圖3h）。由于tsRNAs的大小通常小于50 nt，所以將14-50 nt的RNA視為含tsRNAs的RNA，將50 - 100 nt的RNA視為非tsRNAs和陰性對照。EdU表明，轉(zhuǎn)染NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段比轉(zhuǎn)染W(wǎng)T小鼠的片段更能促進細胞增殖（圖3i），而50 - 100 nt的RNA不改變兩組的增殖。CCK-8實驗顯示，來自NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段，而不是來自WT小鼠的14-50 nt RNA片段和來自兩種小鼠的50-100 nt RNA片段，增加損傷后的細胞存活率（圖3j）。因此，NS-KO來源的14-50 nt RNA片段在促進損傷后細胞增殖和存活方面發(fā)揮了重要作用。

圖3 NS-KO衍生的tsRNAs減輕肝損傷

4、tRF-1是NS-KO的核心產(chǎn)物
       為全面分析tsRNAs的代謝特征，分析WT和NS-KO小鼠不同應(yīng)激損傷后tsRNAs的差異，tsRNA-seq鑒定到841個未記錄的tsRNA和104個記錄在tRFdb數(shù)據(jù)庫中的已知tsRNA（圖4a）。NS-KO小鼠的tsRNAs在整個損傷過程中保持相對較高的水平，而tsRNAs在WT D3時達到峰值（圖4b）。因此，作者猜想在整個CCl4重復(fù)注射過程中，第3天是肝細胞增殖和tsRNA生成最活躍的時間（圖2g, 4b），NS-KO小鼠可能具有與WT D3小鼠相似的“促修復(fù)tsRNA模式”。
       在進一步分析WT和NS-KO小鼠肝損傷不同階段的tsRNAs圖譜后，發(fā)現(xiàn)與其他tsRNAs相比，NS-KO小鼠的tRF-1s突然增加。在所有肝損傷時間點，NS-KO組的tRF-1s都明顯多于WT組，但WT組只在第3天有所增加（圖4c，d）。對tRF-1s的詳細分析顯示，tRF-1s的長度主要在14到23 nt之間（圖4d）?？偟膩碚f，NSun2缺失主要在肝臟中產(chǎn)生14-23 nt的tRF-1s。此外，NS-KO小鼠的tRF-1表達高于WT小鼠，而其他類型的tsRNAs在NS-KO小鼠中的表達低于WT小鼠（圖1e）?？傊瑃RF-1是NS-KO阻止肝損傷和響應(yīng)壓力應(yīng)激的核心產(chǎn)物。

圖4 tsRNA-seq顯示應(yīng)激條件下WT和NS-KO小鼠中tRF-1的特征

5、篩選的tRF-1在體外和體內(nèi)對肝損傷有拯救作用
       如上所述，肝損傷的副產(chǎn)物主要是tRF-1s。為闡明tRF-1s是否可以作為治療肝損傷的一種潛在方法，人工合成了圖4所示的68個tRF-1s。用硫代磷酸酯（PS）、2'-O-甲基（2'-OMe）和膽固醇修飾tRF-1s，以提高其穩(wěn)定性和體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率（圖5a）。然后，將人工合成的 tRF-1s 轉(zhuǎn)染到HL-7702細胞和原代人類肝細胞（PHH）中，并在體外和體內(nèi)驗證它們的功能。EdU試驗表明，合成的tRF-1s能促進細胞增殖（圖5b）。CCK-8檢測顯示，過表達tRF-1s后細胞活力提高（圖5c）。在PHH中，也得到了一致的結(jié)果（圖5d，e）。為驗證改良合成的tRF-1s在體內(nèi)的功能，給肝損傷小鼠靜脈注射tRF-1s。首先，選擇了一種tRF-1（tRF-Met-CAT-049）來測定小RNA在體內(nèi)的代謝時間過程。結(jié)果顯示，tRF-Met-CAT-049在注射后第1天開始表達，第3天達到峰值。因此，只注射一次tsRNAs就治愈了肝損傷小鼠（圖5f-i），因為注射的RNAs可以在這段時間內(nèi)保持高水平表達。之后，進一步從68個潛在的tRF-1中篩選出最有效的tRF-1。作者發(fā)現(xiàn)，篩選到的tG026在體內(nèi)可以改善肝損傷（圖5j, k），NS-KO后tG026的表達增加（圖5l, m）。綜上所述，通過篩選，tG026可以改善上述肝損傷。

圖5篩選的tG026促進了損傷后細胞的增殖和存活

6、tG026抑制TSR1與18S rRNA的相互作用以降低全局蛋白質(zhì)合成
       為探索tG026的潛在機制，進行RNA pull-down-LC-MS/MS檢測，以篩選與tG026相互作用的蛋白質(zhì)（圖6a）。在尋找HL-7702和AML12細胞系中與tG026 相互作用的共同蛋白后（圖6b），選擇參與Pre-40S核糖體組裝的前rRNA處理蛋白TSR1同源物（TSR1）進行后續(xù)實驗。作者推測tG026可能會調(diào)控核糖體。通過RNA pull-down，驗證了TSR1和tG026在兩種細胞系中的相互作用（圖6c，d）。tG026抑制TSR1與核糖體之間的相互作用，因為18S rRNA是核糖體復(fù)合物的重要組成部分（圖6e, f）。最后，OP-Puro incorporation 實驗證實tG026抑制全局蛋白質(zhì)合成（圖6g, h）。

圖6 tG026抑制TSR1與18S rRNA的相互作用以降低GPS

       總而言之，缺失NSun2可減輕注射CCl₄對肝臟造成的損傷。機制上，NSun2 的缺失會減少m5U和m5C的修飾。因此，tRNA變得不穩(wěn)定并產(chǎn)生tsRNA，尤其是tRF-1。通過進一步篩選實驗，發(fā)現(xiàn)tG026通過與TSR1相互作用，抑制了TSR1與18S rRNA之間的關(guān)聯(lián)，從而減少了全局蛋白質(zhì)合成，減輕肝損傷。

圖7 tG026參與肝損傷的機制模型。

實驗方法
肺損傷小鼠建模，轉(zhuǎn)染，細胞增殖實驗，細胞活力實驗，WB，劃痕實驗，HE染色，免疫熒光，免疫組化，qRT-PCR，天狼星紅染色，LC-MS檢測tRNA修飾，small RNA測序，人工合成tsRNA和體內(nèi)注射，肝部分切除術(shù)（PH），RNA pull-down，蛋白組學(xué)分析，RIP，體外和體內(nèi)檢測蛋白總體水平
參考文獻
Ying S, Li P, Wang J, Chen K, Zou Y, Dai M, Xu K, Feng G, Zhang C, Jiang H, Li W, Zhang Y, Zhou Q. tRF-Gln-CTG-026 ameliorates liver injury by alleviating global protein synthesis. Signal Transduct Target Ther. 2023 Apr 3;8(1):144. doi: 10.1038/s41392-023-01351-5. PMID: 37015921; PMCID: PMC10073094.