CircXRN2通過激活Hippo通路抑制由組蛋白乳酸化驅(qū)動的人膀胱癌腫瘤進(jìn)展

       膀胱癌(BCa)是世界上第四大最常見的預(yù)后不良的惡性腫瘤。需要進(jìn)一步的探索和研究來揭示circRNA的潛在作用和分子機(jī)制。在目前的研究中，我們的研究結(jié)果表明，circXRN2通過激活人類膀胱癌中的Hippo通路，抑制由組蛋白乳酸化驅(qū)動的腫瘤進(jìn)展。在本研究中，CircXRN2在膀胱癌組織和細(xì)胞系中異常下調(diào)。CircXRN2在體內(nèi)和體外均能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此外，circXRN2作為糖酵解和乳酸生成的負(fù)調(diào)節(jié)因子。從機(jī)制上講，circXRN2通過與SPOP降解因子結(jié)合，阻止LATS1進(jìn)行SPOP介導(dǎo)的降解，進(jìn)而激活Hippo信號通路，發(fā)揮多種生物學(xué)功能。circXRN2-Hippo通路調(diào)節(jié)軸通過抑制H3K18乳酸化和LCN2的表達(dá)進(jìn)一步調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展。我們的研究結(jié)果為人類膀胱癌的臨床干預(yù)提供了新的治療靶點(diǎn)和有希望的策略。本文于2023年9月發(fā)表于“Molecular Cancer”（IF=37.3）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）LATS1在膀胱癌中下調(diào)，并與circXRN2相互作用
       LATS1是Hippo信號通路中重要的促進(jìn)分子，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。如圖1a所示，組織芯片和臨床樣本顯示，與鄰近正常組織相比，膀胱癌組織中LATS1異常下調(diào)。通過RNA免疫沉淀(RIP)和高通量測序，我們獲得了一個(gè)可能與LATS1蛋白相互作用的circRNAs數(shù)據(jù)庫(圖1b)。為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)可能參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的特異性circRNAs，我們驗(yàn)證了數(shù)據(jù)庫中circRNAs在永生化人正常尿道上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)和膀胱癌細(xì)胞系(5637、T24、EJ、TCCSUP和UM-UC-3)中的表達(dá)水平。結(jié)果，我們在膀胱癌細(xì)胞系中鑒定出14種表達(dá)水平非常低的circRNA(圖1c)。此外，我們使用RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LATS1與上述circRNAs之間的親和力，其中circXRN2 (hsa_circ_0001134)對LATS1蛋白的結(jié)合效率和親和力最高(圖1d)。此外，我們通過qRT-PCR驗(yàn)證了circXRN2在臨床腫瘤組織中的失調(diào)(圖1e)。值得注意的是，腫瘤細(xì)胞系中circXRN2的表達(dá)水平在一定程度上與Hippo通路關(guān)鍵分子TAZ和YAP的激活相關(guān)(圖1f和g)。這些發(fā)現(xiàn)表明，circXRN2可能參與了LATS1和Hippo信號通路的調(diào)節(jié)。

2）CircXRN2在體外和體內(nèi)抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移
       根據(jù)Sanger測序，我們確定了circXRN2的連接位點(diǎn)序列(圖1)。然后，我們使用發(fā)散引物和收斂引物進(jìn)行qRT-PCR。圖1i的結(jié)果表明，circXRN2只能被cDNA中的發(fā)散引物擴(kuò)增，這證實(shí)了circXRN2的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而不是線性結(jié)構(gòu)。與線性RNA相比，circRNA在內(nèi)源性環(huán)境中更加穩(wěn)定，因此不易降解。由于這一特性，我們用RNase R處理樣品，發(fā)現(xiàn)circXRN2可以耐受RNase R的消化，而線性XRN2 mRNA幾乎完全被降解(圖1j)。最后，RNA FISH顯示circXRN2主要定位于膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖1k)。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)行了CCK8測定來評估細(xì)胞活力，結(jié)果證明了circXRN2的抑制作用(圖2a)。同樣，我們通過集落形成實(shí)驗(yàn)來測試circXRN2在細(xì)胞增殖中的生物學(xué)功能，結(jié)果與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(圖2b)。此外，circXRN2的過表達(dá)也會引發(fā)細(xì)胞凋亡(圖2c)。在細(xì)胞遷移能力方面，如圖2d和e所示，circXRN2也降低了細(xì)胞遷移能力。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們建立了裸鼠皮下移植瘤發(fā)生模型和尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果表明，circXRN2可以降低皮下腫瘤的生長速度和重量(圖2f-i)。同樣，circXRN2過表達(dá)組的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量遠(yuǎn)低于陰性對照組(圖2j-l)。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明circXRN2在體外和體內(nèi)抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移。

3）CircXRN2阻止SPOP介導(dǎo)的LATS1降解
       為了揭示circXRN2和LATS1之間的相互作用，我們構(gòu)建了表達(dá)LATS1不同片段的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中(圖3a)。RIP實(shí)驗(yàn)顯示，在293T細(xì)胞和BCa細(xì)胞中，LATS1蛋白的片段2 (279 aa-525 aa)可與circXRN2相互作用(圖3b)。接下來，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circXRN2上調(diào)LATS1蛋白水平(圖3c和d)。根據(jù)上述結(jié)果，我們假設(shè)circXRN2可能通過翻譯后修飾調(diào)節(jié)LATS1蛋白水平。為了證實(shí)這一猜想，我們用環(huán)己亞胺處理陰性對照和過表達(dá)circXRN2的細(xì)胞，結(jié)果表明circXRN2可以延長LATS1蛋白的半衰期(圖3e)。此外，硼替佐米(一種蛋白酶體抑制劑)恢復(fù)了circXRN2缺乏腫瘤細(xì)胞中LATS1蛋白的表達(dá)水平(圖3f)。接下來，我們通過IP檢測不同細(xì)胞中LATS1蛋白的泛素化。如圖3g所示，在硼替佐米和N-乙基馬來酰亞胺治療下，在circXRN2過表達(dá)的細(xì)胞中，較少的LATS1蛋白泛素化。綜上所述，這些結(jié)果證實(shí)了circXRN2通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后泛素化調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中的LATS1蛋白水平。
       最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，LATS1是斑點(diǎn)型POZ (SPOP)的潛在底物，SPOP促進(jìn)LATS1的泛素化和降解。如圖3h所示，在膀胱癌細(xì)胞中，LATS1與SPOP蛋白相互作用。接下來，我們將不同濃度的HA標(biāo)記的SPOP轉(zhuǎn)染到膀胱癌細(xì)胞中。結(jié)果顯示，SPOP以劑量依賴的方式下調(diào)LATS1蛋白(圖3i)。有趣的是，SPOP敲除顯著消除了circXRN2缺乏誘導(dǎo)的LATS1蛋白下調(diào)(圖3j)。此外，IP分析顯示，SPOP敲低顯著降低了LATS1蛋白的泛素化(圖3k)。如圖31所示，在LATS1蛋白的N端存在兩個(gè)推測的SPOP結(jié)合基序或“degrons”(SBC1: 327- MQSSS- 341;Sbc2: 429- pqsss - 443)。在我們之前的結(jié)果中，circXRN2與LATS1的片段2 (279 aa-525 aa)相互作用，其中包含SBC1和SBC2。因此，我們推測circXRN2和SPOP可能競爭性地與LATS1蛋白相互作用以調(diào)節(jié)其降解。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們將野生型或突變型LATS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T或膀胱癌細(xì)胞中，證實(shí)了SBC1突變導(dǎo)致SPOP介導(dǎo)的LATS1降解被顯著阻斷，而SBC2的耗盡幾乎沒有影響(圖3m)。同時(shí)，co-IP結(jié)果顯示，野生型LATS1可以結(jié)合SPOP，但SBC1突變體LATS1與SPOP的相互作用幾乎完全減弱(圖3n)。最后，如圖3o所示，我們發(fā)現(xiàn)circXRN2的敲低促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞中SPOP和LATS1的相互作用。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明circXRN2阻止了LATS1由SPOP介導(dǎo)的降解。

4）CircXRN2在膀胱癌中作為糖酵解和乳酸生成的抑制因子
       許多研究報(bào)道了Hippo通路在細(xì)胞糖酵解代謝中的調(diào)節(jié)作用。鑒于circXRN2、LATS1和Hippo通路之間的密切關(guān)系，我們假設(shè)circXRN2在膀胱癌細(xì)胞的糖酵解中起關(guān)鍵作用。為了驗(yàn)證這一推測，我們過表達(dá)circXRN2，并進(jìn)行了2-NBDG攝取檢測、葡萄糖攝取試驗(yàn)和乳酸生成測定。上述實(shí)驗(yàn)證明，circXRN2降低了T24和TCCSUP細(xì)胞的葡萄糖攝取和乳酸生成(圖4a-c)。海馬糖酵解率分析結(jié)果顯示，過表達(dá)circXRN2的膀胱癌細(xì)胞中g(shù)lycoPER、基礎(chǔ)糖酵解和代償性糖酵解均低于正常腫瘤細(xì)胞(圖4d)。綜上所述，circXRN2在T24和TCCSUP細(xì)胞的糖酵解和乳酸代謝中起負(fù)作用。

5）CircXRN2通過穩(wěn)定LATS1激活Hippo通路，調(diào)節(jié)膀胱癌進(jìn)展、糖酵解和乳酸生成
       為了證實(shí)circXRN2/LATS1軸調(diào)控膀胱腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能和葡萄糖代謝，我們在過表達(dá)circXRN2的細(xì)胞中敲低了LATS1蛋白。免疫印跡分析顯示了LATS1、TAZ和YAP的蛋白水平(圖5a)，免疫熒光證實(shí)了TAZ/YAP在細(xì)胞內(nèi)的位置(圖5b)。CCK-8實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，LATS1的缺失逆轉(zhuǎn)了circXRN2誘導(dǎo)的對細(xì)胞活力和增殖的抑制作用(圖5c和d)。同時(shí)，通過Transwell實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)確定了細(xì)胞遷移。與circXRN2過表達(dá)的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染shLATS1的細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)(圖5e和f)。此外，通過2-NBDG攝取測定、葡萄糖攝取測定和乳酸生成檢測，分別測定對照組、circXRN2過表達(dá)組和circXRN2 + shLATS1組的葡萄糖攝取能力和乳酸生成。圖5g-i顯示shLATS1減輕了circXRN2對糖酵解代謝的抑制。隨后，通過海馬代謝分析儀對不同細(xì)胞的glycoPER、基礎(chǔ)糖酵解率和代償糖酵解率進(jìn)行分析計(jì)算，結(jié)果也支持上述結(jié)論(圖5j)。

6）circXRN2調(diào)控組蛋白乳酸化促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生
       我們利用2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG，一種糖酵解抑制劑)和草氨酸鹽(一種乳酸脫氫酶抑制劑)來證實(shí)膀胱癌細(xì)胞中糖酵解、整體乳酸化和組蛋白乳酸化之間的關(guān)系。如圖6b-d所示，2-DG和草氨酸鹽以劑量依賴的方式降低了全局乳酸化修飾和H3K18乳酸化修飾，并被LDH耗盡完全抑制?？紤]到circXRN2對糖酵解和乳酸生成的影響，我們假設(shè)circXRN2可能參與了膀胱癌中組蛋白的乳酸化。正如我們假設(shè)的那樣，圖6e中的結(jié)果顯示circXRN2顯著降低了全局乳酸化和H3K18乳酸化水平。值得注意的是，在膀胱癌細(xì)胞系中，全局乳酸化和H3K18乳酸化是異常的，這表明它們在腫瘤發(fā)生中的潛在作用(圖6f)。此外，為了驗(yàn)證組蛋白乳酸化在膀胱癌中的生物學(xué)功能，我們消除了內(nèi)源性LDHA和LDHB，以降低整體乳酸化和H3K18乳酸化水平，并補(bǔ)充乳酸鈉進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)表明，組蛋白乳酸化在細(xì)胞增殖和集落形成能力中起著至關(guān)重要的作用(圖6g和h)。此外，同時(shí)消除LDHA和LDHB也會損害T24和TCCSUP細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力(圖6i和j)。乳酸鈉可以減弱LDHA/B缺乏誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖(圖6g和h)和遷移(圖6i和j)的抑制。綜上所述，這些結(jié)果表明組蛋白H3K18乳酸化是由circXRN2調(diào)節(jié)的，并參與了膀胱癌的腫瘤發(fā)生。

7）LCN2是H3K18乳酸化的靶點(diǎn)，是膀胱癌的致癌基因
       為了揭示H3K18乳酸化的調(diào)控機(jī)制，我們在T24細(xì)胞中使用ChIP級H3K18la抗體和IgG進(jìn)行了CUT&Tag。如圖7a所示，H3K18la可以在許多基因的啟動子區(qū)域富集。同時(shí)，KEGG數(shù)據(jù)庫分析顯示，在我們的CUT&Tag測序中，H3K18la相關(guān)基因在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的多種信號通路中富集(圖7b)，表明H3K18la在人類膀胱癌進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。然后，我們對circXRN2過表達(dá)或不過表達(dá)的T24和TCCSUP細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并將這些結(jié)果與CUT&Tag數(shù)據(jù)和PubMed數(shù)據(jù)庫相結(jié)合，選擇LCN2、NARP和KRT80作為候選基因(圖7c和d)。LCN2、NARP和KRT80啟動子區(qū)域富集H3K18la或IgG的信號如圖7e所示。接下來，我們在circXRN2過表達(dá)的細(xì)胞中驗(yàn)證了上述靶點(diǎn)在mRNA水平上的表達(dá)，結(jié)果表明，circXRN2可以顯著調(diào)節(jié)LCN2。然后，在過表達(dá)circXRN2的T24和TCCSUP細(xì)胞中驗(yàn)證LCN2 mRNA和LCN2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LCN2被circXRN2顯著下調(diào)(圖7f)。此外，糖酵解抑制劑也在蛋白水平上調(diào)節(jié)LCN2的表達(dá)(圖7g)。我們在TCGA數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，LCN2在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與膀胱癌進(jìn)展密切相關(guān)(圖7h)?；谝陨献C據(jù)，我們選擇LCN2進(jìn)行下面的研究。根據(jù)我們之前的CUT&Tag測序，我們設(shè)計(jì)了針對LCN2啟動子不同區(qū)域的特異性引物，ChIP實(shí)驗(yàn)顯示H3K18la富集在LCN2啟動子中。值得注意的是，H3K18la與LCN2啟動子之間的相互作用可以被糖酵解抑制劑和circXRN2減少，進(jìn)一步表明H3K18la在LCN2轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵作用(圖7i, j)。最后，我們探討了LCN2在LCN2缺失的T24和TCCSUP細(xì)胞中的生物學(xué)功能。如圖7k-n所示，LCN2的缺失顯著降低了腫瘤細(xì)胞的增殖、集落形成和遷移。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明LCN2直接受H3K18乳酸化調(diào)控，并在人類膀胱癌中發(fā)揮致癌基因的作用。

8）circXRN2?LATS1軸在體內(nèi)抑制膀胱癌細(xì)胞的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移
       為了驗(yàn)證circXRN2-LATS1軸是否在體內(nèi)抑制膀胱癌細(xì)胞的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，我們將不同處理(對照、circXRN2過表達(dá)、circXRN2 + shLATS1)的細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)類似，過表達(dá)circXRN2可顯著降低腫瘤生長速率，敲低LATS1顯著減弱了circXRN2引起的抑制作用(圖8a-d)。我們還通過向裸鼠尾靜脈注射不同的T24細(xì)胞，建立裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型，評估細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力。如圖8eg所示，與正常對照組相比，過表達(dá)circXRN2顯著減少了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而在circXRN2過表達(dá)并敲低LATS1的細(xì)胞中，腫瘤結(jié)節(jié)顯著增加。此外，我們通過免疫組織化學(xué)和western blotting檢測不同治療組腫瘤中LATS1、TAZ/YAP、LCN2和H3K18la的表達(dá)水平，結(jié)果與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(圖8h-i)。同時(shí)，我們評估了LCN2 mRNA在不同腫瘤中的表達(dá)水平(圖8j)?？傊?，我們的研究結(jié)果表明，circXRN2通過激活Hippo信號通路抑制人類膀胱癌中由H3K18乳酸化介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展。

結(jié)論
       我們證實(shí)circXRN2通過調(diào)節(jié)H3K18乳酸化抑制膀胱癌的進(jìn)展。從機(jī)制上講，circXRN2與LAST1蛋白結(jié)合，保護(hù)其免受SPOP介導(dǎo)的泛素化和降解，從而激活Hippo信號通路，抑制H3K18的乳酸化。我們的發(fā)現(xiàn)將有助于發(fā)現(xiàn)新的分子靶點(diǎn)和治療人類膀胱癌的策略。

實(shí)驗(yàn)方法
RIP，CUT&Tag，F(xiàn)ISH，糖酵解率測定，qRT-PCR，ChIP，IP，CCK-8，克隆形成實(shí)驗(yàn)，transwell，傷口愈合試驗(yàn)，流式，WB，免疫熒光。
參考文獻(xiàn)
Xie B, Lin J, Chen X, Zhou X, Zhang Y, Fan M, Xiang J, He N, Hu Z, Wang F. CircXRN2 suppresses tumor progression driven by histone lactylation through activating the Hippo pathway in human bladder cancer. Mol Cancer. 2023 Sep 8;22(1):151. doi: 10.1186/s12943-023-01856-1.