STAT5通過促進(jìn)組蛋白乳酰化促進(jìn)PD-L1表達(dá)，以驅(qū)動急性髓系白血病的免疫抑制

       隨著基因組學(xué)和免疫學(xué)的快速發(fā)展，免疫治療成為一種革命性的腫瘤治療策略，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤中取得了成功。然而，急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一種異質(zhì)性疾病，目前仍缺乏基于PD-1/PD-L1阻斷的免疫治療在AML中的應(yīng)用的系統(tǒng)證明。因此，迫切需要識別驅(qū)動腫瘤免疫抑制的分子，并根據(jù)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的獲益對患者進(jìn)行分層。在這里，作者報道了STAT5在AML隊(duì)列中高表達(dá)，并激活糖酵解基因的啟動子來促進(jìn)AML細(xì)胞中的糖酵解。因此，乳酸積累的增加促進(jìn)了E3BP核易位和組蛋白乳酸化，最終誘導(dǎo)PD-L1轉(zhuǎn)錄。當(dāng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑與STAT5組成型激活的AML細(xì)胞共培養(yǎng)時，可以阻斷微環(huán)境中PD-1/PD-L1與反應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞的相互作用。臨床發(fā)現(xiàn)，在新診斷的AML患者中，骨髓中乳酸的積累與STAT5以及PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān)。因此，作者揭示了STAT5-乳酸-PD-L1網(wǎng)絡(luò)在急性髓細(xì)胞性白血病進(jìn)展中的作用，這表明STAT5誘導(dǎo)糖酵解和乳酸蓄積的急性髓細(xì)胞性白血病患者可能會從基于PD-1/PD-L-1的免疫療法中獲益。本文于2023年9月發(fā)表于《Nature communications》，IF=39.3。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.STAT5通過干擾AML患者的T細(xì)胞功能來減弱免疫狀態(tài)

       為了深入了解正常和惡性造血的免疫異質(zhì)性，作者使用GSE9476數(shù)據(jù)集在健康供者和AML患者之間進(jìn)行了GSEA。結(jié)果顯示，AML患者中多種免疫相關(guān)通路下調(diào)(圖1a)。通過驗(yàn)證T細(xì)胞標(biāo)記在AML患者和健康供者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)上的表達(dá)，作者觀察到AML患者CD8+T細(xì)胞中PD-1和TIM-3的表達(dá)明顯上調(diào)(圖1b)。這些結(jié)果表明，AML患者的T細(xì)胞免疫狀態(tài)嚴(yán)重失調(diào)。
       作者研究了STAT5是否導(dǎo)致AML免疫狀態(tài)失調(diào)。STAT5在AML和健康供者中的表達(dá)通過GSE116256進(jìn)行分析，結(jié)果顯示STAT5 在AML患者的惡性細(xì)胞中高表達(dá)(圖1c, d)。此外，對來自GSE12417的163名AML患者的生存分析顯示，高STAT5表達(dá)與較短的總生存期顯著相關(guān)(圖1e)。接下來，作者比較骨髓單核細(xì)胞（BMMC）和AML的PBMC之間的T細(xì)胞功能差異，但PD-1和CD69在BMMC中的表達(dá)增加（圖1f）。隨后，作者研究發(fā)現(xiàn)STAT5表達(dá)與BMMC的CD8 + T細(xì)胞上的PD-1呈正相關(guān)（圖1g）。因此，STAT5可能干擾患者T細(xì)胞的功能。

2.STAT5的組成型活化促進(jìn)AML細(xì)胞中的糖酵解

       由于STAT5參與控制細(xì)胞代謝，作者通過鑒定GSE12417中的差異表達(dá)基因(DEGs)并根據(jù)STAT5的表達(dá)將其分為四分位數(shù)，繼續(xù)評估STAT5如何影響白血病糖酵解。GSEA顯示，STAT5高表達(dá)的AML患者的代謝途徑上調(diào)（圖2a）。然后，作者構(gòu)建了STAT5組成激活(cS5) AML細(xì)胞，并檢測糖酵解酶的表達(dá)。STAT5促進(jìn)糖酵解酶的表達(dá)，包括HK1、PFKP 和PDHA。同時，評估代謝增強(qiáng)的指標(biāo)磷酸化AKT (p AKT)在cS5過表達(dá)的細(xì)胞中也升高（圖2b-d）。此外，糖酵解基因的熒光素酶報告基因活性被STAT5強(qiáng)效誘導(dǎo)（圖2e）。
       因此，STAT5可以激活HK1、FKP 和PDHA的啟動子，促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而上調(diào)葡萄糖代謝。作者進(jìn)行了GC-MS非靶向代謝組學(xué)研究cS5過表達(dá)的AML細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)112種代謝物發(fā)生了改變（圖2f）。如圖2g所示，通過 KEGG 富集分析，cS5過表達(dá)的AML細(xì)胞中的葡萄糖、氨基酸和核苷酸代謝等代謝途徑發(fā)生了變化。值得注意的是，糖酵解中的葡萄糖、檸檬酸、異檸檬酸、d -核糖5-磷酸和l -乳酸在cS5過表達(dá)的AML細(xì)胞中增加（圖2h）。cS5過表達(dá)的白血病細(xì)胞表現(xiàn)出糖酵解代謝的顯著增加，通過增強(qiáng)葡萄糖攝?。▓D2i）、乳酸生成（圖2j）和丙酮酸含量（圖2k）來判斷。同時，糖酵解應(yīng)激試驗(yàn)也表明，cS5過表達(dá)的AML細(xì)胞的細(xì)胞外酸化率(ECAR)升高（圖21）。此外，STAT5的敲低（圖2m）降低了乳酸的產(chǎn)生和丙酮酸含量（圖2n，o）。作者進(jìn)一步證實(shí)， STAT5 的表達(dá)與AML患者骨髓(BM)中的乳酸生成呈正相關(guān)(圖2p)。這些結(jié)果表明，STAT5可以上調(diào)AML中的糖酵解。通過去除培養(yǎng)基中的葡萄糖，這種作用得以恢復(fù)(圖2q, r)。一致地，將AML細(xì)胞暴露于2-脫氧-d-葡萄糖(2-DG)后，cS5誘導(dǎo)的增殖可以逆轉(zhuǎn)(圖2s)，這表明STAT5主要通過增加糖酵解來促進(jìn)白血病生長。

3.T5介導(dǎo)乳酸誘導(dǎo)的AML細(xì)胞中PD-L1表達(dá)

       作者為了探討STAT5在調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)中的作用，通過流式細(xì)胞術(shù)和qPCR分析發(fā)現(xiàn)，cS5顯著上調(diào)了PD-L1的表達(dá)(圖 3a, b)。為了解決乳酸誘導(dǎo)的PD-L1在AML中表達(dá)的生物學(xué)相關(guān)性，將乳酸直接供給AML細(xì)胞，誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)(圖3c)。PD-L1表達(dá)與AML患者骨髓中STAT5表達(dá)或乳酸含量呈正相關(guān)(圖3e, f)的結(jié)果支持了這一觀點(diǎn)。作者進(jìn)一步評估了通過將細(xì)胞暴露于提供不同劑量葡萄糖的培養(yǎng)基中，糖酵解是否可以增強(qiáng)PD-L1表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)和qPCR顯示葡萄糖刺激的AML細(xì)胞中PD-L1表達(dá)增加（圖3g，h）。相反，當(dāng)cS5過表達(dá)的AML細(xì)胞暴露于2-DG時，PD-L1表達(dá)和乳酸含量減弱（圖3i）。在STAT5敲除的AML細(xì)胞中，PD-L1的減少可以通過額外的乳酸恢復(fù)(圖3j)。此外，AML細(xì)胞暴露于不同的化合物中，這些化合物可以將氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒狻?結(jié)果顯示，AML細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與乳酸生成呈正相關(guān)(圖3k)。然后，作者使用熒光素酶報告測定法分析了乳酸對PD-L1啟動子活性的影響。重要的是，乳酸暴露后PD-L1啟動子活性明顯增強(qiáng)（圖3l）。因此，乳酸可刺激PD-L1啟動子啟動PD-L1表達(dá)。

4.乳酸通過組蛋白乳酰化激活PD-L1基因表達(dá)

       由于STAT5可以改善AML中乳酸的產(chǎn)生(圖2j)，而乳酸化是一種由乳酸介導(dǎo)的新型翻譯后修飾，作者進(jìn)一步研究了乳酸是否可以驅(qū)動乳酸化介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)。事實(shí)上，STAT5可以增加AML細(xì)胞中組蛋白的泛乳酸化(Kla)，而2-DG則相反(圖4a)。作者用額外的乳酸培養(yǎng)AML細(xì)胞，并注意到組蛋白Kla被顯著誘導(dǎo)(圖4b)。接下來，作者評估了對照組和cS5過表達(dá)的AML細(xì)胞之間組蛋白特異性殘基的乳酸化水平。STAT5誘導(dǎo)H3K18、H4K5、H4K8和H4K12的乳酸化水平(圖4c)。 培養(yǎng)液中額外的乳酸顯著誘導(dǎo)特定殘基的組蛋白乳糖化(圖4d)。一致地， 通過將AML細(xì)胞暴露于不同濃度的葡萄糖或2-DG來改變?nèi)樗嵘煽梢苑謩e改變?nèi)樗峄?圖4e)。此外，在STAT5敲除的AML細(xì)胞中觀察到組蛋白乳酸化減弱(圖4f)。同時，免疫熒光分析也支持上述結(jié)果(圖4h)。乳酸源性H3K18的乳酸化已被證明可以直接刺激基因表達(dá)。同樣，在cS5過表達(dá)的AML細(xì)胞中，PD-L1啟動子區(qū)域中H4K5的乳酸化水平顯著富集(圖4i)。此外，通過將 AML 細(xì)胞暴露于更高濃度的葡萄糖中以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)乳酸生成，H4K5乳酸化的富集也增加了(圖4j)。因此，乳酸激活的PD-L1 基因表達(dá)可能是通過PD-L1啟動子上的組蛋白乳酸化實(shí)現(xiàn)的。

5.E3BP的核定位促進(jìn)AML細(xì)胞中的H4K5乳酸化

       為了尋找AML細(xì)胞中調(diào)節(jié)組蛋白乳酸化的分子，作者使用LC-MS/MS驗(yàn)證了乳酸化H4K5的結(jié)合蛋白。結(jié)果表明，丙酮酸脫氫酶(PDH)復(fù)合物的組成部分E3BP可以與白血病細(xì)胞中的乳酸化H4K5相互作用 (圖5a)。同時，根據(jù)STAT5的表達(dá)將源自GSE12417的AML患者分為四分位數(shù)，然后分析E3BP的表達(dá)。在STAT5高表達(dá)的AML患者中， E3BP (PDHX)基因表達(dá)升高(圖5b)。接下來，作者構(gòu)建了E3BP過表達(dá)的AML細(xì)胞，然后檢測組蛋白乳酸化。結(jié)果顯示，E3BP在AML細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)組蛋白乳酸化，包括H3K18、H4K5、H4K8和H4K12(圖5c)。 此外，免疫熒光還顯示，E3BP過表達(dá)后，Kla和H4K5乳酸化升高(圖5d, e)。出乎意料的是，在cS5過表達(dá)的AML細(xì)胞中，E3BP在細(xì)胞核中富集，這表明E3BP核定位受STAT5調(diào)節(jié)(圖5f)。與此一致的是， E3BP核易位在乳酸處理的AML細(xì)胞中升高(圖5g-i)。此外，Co-IP 表明，在乳酸處理后，更多的E3BP與乳酸化H4K5相互作用(圖5j, k)。一致地，AML細(xì)胞在E3BP過表達(dá)后表現(xiàn)出更高的PD-L1水平(圖5l)。這些結(jié)果表明，乳酸促進(jìn)E3BP核易位有助于組蛋白乳酸化。

6.STAT5通過上調(diào)PD-L1表達(dá)抑制T細(xì)胞活化

       基于作者發(fā)現(xiàn)STAT5驅(qū)動AML細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)(圖3a)，作者假設(shè)STAT5 可能抑制PD-L1介導(dǎo)的免疫功能。作者在GSE14468中描述了STAT5 高表達(dá)和低表達(dá)AML患者之間免疫景觀的差異。值得注意的是，在STAT5高表達(dá)的AML細(xì)胞中，免疫評分降低，CD8+T細(xì)胞含量下降(圖6a, b)。隨后，作者在AML細(xì)胞和T細(xì)胞之間進(jìn)行了共培養(yǎng)系統(tǒng)。在cS5衍生的條件培養(yǎng)基(CM)中培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞和對照AML細(xì)胞的活化水平相當(dāng)。然而，Jurkat細(xì)胞與cS5 AML細(xì)胞直接接觸顯示， Jurkat細(xì)胞中CD69的表達(dá)明顯下調(diào)(圖6c)，這表明STAT5 可能通過誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)來抑制 Jurkat 細(xì)胞的活化。作者進(jìn)一步生成 PD-L1 敲除(KO) HL-60 cS5 細(xì)胞(圖 6d)，然后與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)。正如預(yù)期的那樣，Jurkat細(xì)胞通過PD-L1敲除被重新激活(圖6e)。通過使用PD-1中和抗體托利單抗治療Jurkat細(xì)胞，阻斷PD-1/PD-L1 相互作用，也恢復(fù)了Jurkat細(xì)胞的活化(圖6f, g)。PBMCs的 CD8+ T 細(xì)胞在與PD-L1- ko HL-60 cS5 細(xì)胞共培養(yǎng)或暴露于特瑞普利單抗后被重新激活(圖6h, i)，支持AML中PD-L1抑制可能恢復(fù)被STAT5抑制的CD8+ T 細(xì)胞激活。

結(jié)論
       綜上所述， 由STAT5驅(qū)動的乳酸累積促進(jìn)了PD-L1啟動子上組蛋白的乳酸化，并最終誘導(dǎo) PD-L1 的表達(dá)。免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以阻斷STAT5 高表達(dá)AML中PD-1/PD-L1的相互作用，并重新激活CD8+T細(xì)胞。因此，作者的研究證明了新陳代謝-表觀遺傳學(xué)-免疫網(wǎng)絡(luò)在急性髓細(xì)胞性白血病進(jìn)展中的作用，STAT5誘導(dǎo)的乳酸可作為抗PD- (L)1免疫療法應(yīng)用于AML的預(yù)測性生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)
Huang, ZW., Zhang, XN., Zhang, L. et al. STAT5 promotes PD-L1 expression by facilitating histone lactylation to drive immunosuppression in acute myeloid leukemia. Sig Transduct Target Ther 8, 391 (2023). 
生信分析：生物信息學(xué)分析
常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)：質(zhì)粒構(gòu)建、qPCR檢測、免疫印跡檢測、組蛋白提取、免疫熒光染色、免疫共沉淀、熒光素酶報告基因檢測、
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：慢病毒感染 、糖代謝指數(shù)的測量、流式細(xì)胞術(shù)、AML細(xì)胞和T細(xì)胞共培養(yǎng)測定、細(xì)胞糖酵解應(yīng)激試驗(yàn)測定

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