己糖激酶2在肝細(xì)胞癌中通過促進(jìn)AIMP2的自噬依賴性降解賦予放療抵抗

       隨著技術(shù)的進(jìn)步，放療(RT)已成為肝細(xì)胞癌(HCC)有效的非手術(shù)治療手段，全面提高了肝癌患者的局部控制率。然而，一些HCC患者在放療后仍會出現(xiàn)放療抵抗、癌癥復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。我們之前的研究表明，己糖激酶2 (HK2)是一種強效癌基因，在放療抵抗的HCC細(xì)胞系中過表達(dá)；然而，其在HCC放療抵抗中的作用尚不明確。本研究證實了HK2在HCC組織中的上調(diào)與HCC患者的不良預(yù)后有關(guān)，并證明HK2在HCC細(xì)胞系中通過減輕細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖發(fā)揮抗放療作用。HK2下調(diào)與電離輻射聯(lián)合作用表現(xiàn)出良好的協(xié)同致死效應(yīng)。機(jī)制上，HK2通過與AIMP2絡(luò)合，增強其自噬溶酶體依賴性降解，從而減輕電離輻射介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而增加HCC的放療抵抗。藥理學(xué)上，酮康唑可作為HK2的抑制劑，協(xié)同增強RT的療效。我們的研究結(jié)果表明HK2在肝細(xì)胞癌的放療抵抗中起重要作用，可能是提高RT療效的潛在治療靶點。本文于2023年8月發(fā)表于Cell Death and Disease（IF=9.0）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）高HK2表達(dá)有助于肝細(xì)胞癌的放療抵抗，并預(yù)示預(yù)后不良
       在本研究中，我們觀察到HK2蛋白水平在固有IR-R (QGY7701) HCC細(xì)胞系中隨著時間的推移而升高，而在放療敏感的HCC細(xì)胞系MHCC97H和MHCC97L中則保持不變。此外，在獲得的IR-R細(xì)胞系中，HK2并沒有隨著時間的推移而上調(diào)(圖1A)，這可能是因為在IR-R細(xì)胞系構(gòu)建過程中持續(xù)的放療使高表達(dá)HK2的細(xì)胞群存活。因此，我們假設(shè)HK2是HCC中的放療抵抗基因。為了評估HK2在HCC患者中的表達(dá)，我們分析了GEO數(shù)據(jù)庫(GSE14520和GSE36376)。與鄰近正常組織相比，HCC組織中HK2 mRNA水平升高(圖1B)。Kaplan-Meier生存分析證實，較高的HK2 mRNA表達(dá)預(yù)示著較差的總生存期(OS)。雖然沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但高HK2表達(dá)的患者有更短無復(fù)發(fā)生存期(RFS)的趨勢(圖1C)。Western blotting顯示，來自患者的HCC樣本顯示出更高的HK2蛋白水平(圖1D)。HK2的免疫組化染色(IHC)顯示，高HK2表達(dá)可預(yù)測較短的OS(圖1E, 1F)。單因素和多因素分析顯示，HK2高表達(dá)是HCC患者預(yù)后不良的獨立危險因素(圖1G,1 H)。這些數(shù)據(jù)驗證了HK2在HCC組織中mRNA和蛋白水平上調(diào)，與HCC患者預(yù)后不良呈正相關(guān)。

2）HK2在HCC細(xì)胞中引起顯著的放療抵抗
       為了進(jìn)一步研究HK2介導(dǎo)的放療抵抗，我們在放療敏感細(xì)胞系(MHCC97H和MHCC97L)中構(gòu)建了穩(wěn)定的HK2過表達(dá)細(xì)胞，在放療抵抗細(xì)胞系(MHCC97H IR-R、MHCC97L IR-R和QGY7701)中構(gòu)建了穩(wěn)定的HK2敲低細(xì)胞。對這些編輯細(xì)胞系中的CCK8和集落形成進(jìn)行了評估。經(jīng)IR處理后，LV-HK2顯著促進(jìn)了放療敏感細(xì)胞系的生長，而shHK2顯著降低了放療抵抗細(xì)胞系的生長(圖2A)。為了評估HK2是否調(diào)節(jié)細(xì)胞對IR損傷的反應(yīng)，在指定時間進(jìn)行了組蛋白2A(pH2AX-Ser139)磷酸化的免疫熒光(IF)測定，這是DNA損傷修復(fù)的有效指標(biāo)。pH2AX-Ser139核焦點在LV-HK2細(xì)胞中比在對照細(xì)胞中消散得更快，而shHK2在放療抵抗細(xì)胞中則發(fā)揮相反的作用(圖2B、2C)。由于IR可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，我們對不同HK2水平的細(xì)胞進(jìn)行了凋亡的流式細(xì)胞術(shù)(FCM)。雖然HK2的表達(dá)在沒有IR的情況下對細(xì)胞凋亡沒有顯著影響，但LV-HK2可以減少IR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖2D)。與平行細(xì)胞相比，shHK2與IR聯(lián)合可協(xié)同促進(jìn)放療抵抗細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(圖2D)。Western blotting進(jìn)一步證實，凋亡相關(guān)蛋白，包括Cyto c、Cleaved Caspase 3和Cleaved Caspase 9的水平下降，而抗凋亡蛋白Bcl-xL則隨著HK2的過表達(dá)而升高(圖2E)。這些結(jié)果表明HK2在體外調(diào)節(jié)HCC放療抵抗中起著不可或缺的作用。

3）HK2在體內(nèi)是一種抗放療基因
       在體外實驗的基礎(chǔ)上，我們通過建立裸鼠皮下異種移植模型來研究HK2在體內(nèi)的作用。HK2過表達(dá)可以有效增強放療抵抗，而HK2的低表達(dá)可以提高放療敏感并抑制腫瘤生長(圖3A)。我們通過IHC檢測Ki67，觀察到IR在平行組中顯著抑制細(xì)胞增殖。而在HK2過表達(dá)組中，IR對細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯(圖3B)。在放療抵抗組中，IR對Ki-67的比例影響較小，而在shHK2組中，IR可顯著抑制皮下腫瘤中Ki-67的比例(圖3B)。我們進(jìn)一步將小鼠來源的H22 HCC細(xì)胞植入裸鼠和C57BL/6小鼠皮下異種移植模型。在裸鼠模型中，IR后HK2過表達(dá)組的生長速度高于平行對照組(圖3C)。通過檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性細(xì)胞的比例，我們發(fā)現(xiàn)LV-HK2在IR后增加了放療抵抗并維持了增殖(圖3D)。皮下接種H22 LV-RFP的C57BL/6小鼠中，腫瘤消退更快，更頻繁(圖3E)。隨后的PCNA免疫組化表明，H22 LV-HK2細(xì)胞在IR后比H22 LV-RFP細(xì)胞增殖更活躍(圖3F)。我們還研究了CD8+ T細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞的浸潤情況。我們的數(shù)據(jù)顯示，與接種H22 LV-RFP細(xì)胞的小鼠相比，接種H22 LV-HK2細(xì)胞的小鼠CD8+ T細(xì)胞浸潤減少，M2巨噬細(xì)胞(CD163+)增加(圖3F)，這意味著HK2可能與IR協(xié)同作用抑制免疫系統(tǒng)，從而促進(jìn)HCC的放療抵抗。

4）HK2通過調(diào)節(jié)溶酶體依賴性自噬抑制AIMP2蛋白
       為了探索HK2介導(dǎo)的放療抵抗的分子機(jī)制，進(jìn)行了免疫沉淀(IP)和銀染色試驗。使用特異性抗原帶的質(zhì)譜法獲得AIMP2蛋白。這些結(jié)果在IR后MHCC97H LV-HK2和MHCC97L LV-HK2細(xì)胞中得到證實(圖4A)。Western blotting結(jié)果顯示，IR處理后，AIMP2在HK2過表達(dá)細(xì)胞系中顯著下調(diào)，而在HK2敲低細(xì)胞系中上調(diào)(圖4B)。根據(jù)先前的研究，HK2不作為轉(zhuǎn)錄因子。因此，我們推斷HK2通過轉(zhuǎn)錄后修飾介導(dǎo)AIMP2下調(diào)。為了確認(rèn)未編輯細(xì)胞中HK2和AIMP2之間的關(guān)系，我們進(jìn)行了Co-IP。我們觀察到HK2和AIMP2僅在IR后才在蛋白水平上共定位(圖4C)。同時進(jìn)行了IF。IR后，細(xì)胞質(zhì)中HK2信號與AIMP2信號重疊，而沒有IR時則不重疊(圖4D)。這些結(jié)果證實了HK2和AIMP2在細(xì)胞和蛋白水平上的共定位。接著，我們使用自噬抑制劑氯喹(CQ)或蛋白酶體抑制劑MG-132預(yù)處理放療敏感的LV-RFP和LV-HK2細(xì)胞，然后進(jìn)行IR預(yù)處理。CQ處理成功逆轉(zhuǎn)了AIMP2的下調(diào)，而MG-132處理則沒有(圖4E)。為了進(jìn)一步研究自噬在AIMP2降解中的作用，WB檢測了經(jīng)典自噬相關(guān)蛋白LC3、P62和Beclin1的表達(dá)。與IR聯(lián)合使用時，與LV-RFP組相比，LV-HK2上調(diào)Beclin1水平，增強LC3 II脂化，下調(diào)P62水平；而shHK2的作用則相反(圖4F)。LC3 II的IF也與HK2的表達(dá)呈正相關(guān)(圖4G, H)。自噬泡的透射電鏡(TEM)圖像顯示，放療抵抗細(xì)胞系在IR后比放療敏感細(xì)胞系產(chǎn)生更多的自噬泡，進(jìn)一步證明了HK2與自噬之間的關(guān)系(圖4I)。轉(zhuǎn)染mCherry-GFP標(biāo)記的LC3 II后，在放療抵抗細(xì)胞系中觀察到更多的自噬泡和自噬通量上調(diào)(圖4J)。這些結(jié)果表明HK2與IR聯(lián)合上調(diào)自噬，并進(jìn)一步降低AIMP2蛋白水平。

5）HK2的抗放療效應(yīng)部分是由AIMP2降解引起的
       我們假設(shè)HK2在放療抵抗中的作用部分是由AIMP2功能受損介導(dǎo)的。Western blotting和FCM顯示siAIMP2能夠部分逆轉(zhuǎn)IR后shHK2引起的細(xì)胞凋亡上調(diào)(圖5A, 5B)。相應(yīng)地，LV-AIMP2部分促進(jìn)IR后由于LV-HK2而減少的細(xì)胞凋亡(圖5A,5B)。在體內(nèi)，在IR后的MHCC97H LV-HK2和LV-RFP細(xì)胞中，AIMP2過表達(dá)減緩了腫瘤的生長。在LV-HK2組中，與對照組相比，高水平的AIMP2導(dǎo)致HK2過表達(dá)引起的腫瘤體積增加的保持(圖5C)。Cyto C和Ki67的免疫組化表明，AIMP2的高表達(dá)增強了LV-HK2細(xì)胞的凋亡，部分抑制了HK2過表達(dá)引起的增殖增加(圖5D)。這些結(jié)果表明HK2的放療抵抗功能部分是由于AIMP2在體內(nèi)的降解。

6）藥理抑制HK2可顯著減輕其抗放療作用
       考慮到HK2在HCC中的主要表達(dá)，我們推測HK2抑制可能對HCC具有高度選擇性。酮康唑(Ketoconazole, Keto)是FDA批準(zhǔn)的常用抗真菌藥物，通過靶向HK2抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。CCK8實驗顯示，Keto治療部分抑制細(xì)胞存活，而Keto和IR聯(lián)合治療進(jìn)一步促進(jìn)了協(xié)同致死效應(yīng)(圖6A)。Western blotting顯示，Keto部分增強了LV-HK2細(xì)胞的凋亡水平，與IR結(jié)合進(jìn)一步增加細(xì)胞凋亡(圖6B)。隨后建立MHCC97H LV-HK2或H22 LV-HK2裸鼠皮下異種移植模型。在IR治療前一天開始腹腔注射Keto，并以20 mg/Kg的濃度每兩天維持一次(圖6C)。Keto和IR治療均部分減少腫瘤體積并抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而聯(lián)合治療可協(xié)同抑制腫瘤體積和生長速率(圖6D, 6E)。免疫組化實驗顯示，與單獨使用Keto或IR相比，Keto聯(lián)合IR顯著抑制了增殖和自噬，并提高了凋亡(圖6G)。Keto治療對小鼠體重和肝腎指標(biāo)沒有影響(圖61、6J)。同樣，聯(lián)合治療對H22 LV-HK2皮下移植C57BL/6小鼠腫瘤生長的抑制作用較其他治療組明顯(圖6F)。免疫組化實驗也顯示了同樣的結(jié)果(圖6H)。同樣，小鼠的體重和活力也沒有受到影響(圖6K、6L)。此外，聯(lián)合治療組腫瘤中CD8+ T浸潤增加，M2巨噬細(xì)胞減少，表明聯(lián)合治療對免疫缺陷的逆轉(zhuǎn)效果更好(圖6M-6P)。這些體外和體內(nèi)實驗結(jié)果表明，HK2的藥理靶向可能是HCC中IR的有效輔助手段，具有很大的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

結(jié)論
       這項研究揭示了HK2在HCC放療抵抗中的作用。HK2可能成為HCC放療的潛在治療靶點。

實驗方法
CCK8，克隆形成實驗，WB，IHC，qRT-PCR，流式，免疫共沉淀，銀染，免疫熒光。
參考文獻(xiàn)
Zheng Y, Zhan Y, Zhang Y, Zhang Y, Liu Y, Xie Y, Sun Y, Qian J, Ding Y, Ding Y, Fang Y. Hexokinase 2 confers radio-resistance in hepatocellular carcinoma by promoting autophagy-dependent degradation of AIMP2. Cell Death Dis. 2023 Aug 1;14(8):488. doi: 10.1038/s41419-023-06009-2.