單細(xì)胞分析+m6A?狙擊 結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境

摘要
       N6甲基腺苷（m6A）RNA甲基化在各種癌癥的關(guān)鍵遺傳事件中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用；然而，m6A如何在腫瘤微環(huán)境（TME）中發(fā)揮作用仍誘導(dǎo)闡明。通過非陰性機(jī)制因子分解（NMF）分析了來自33例CRC腫瘤樣本的單細(xì)胞scRNA-seq數(shù)據(jù)中的65362個(gè)單細(xì)胞，其中23個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子。使用來自公共儲(chǔ)存庫的CRC和免疫治療隊(duì)列來確定TME集群的預(yù)后和免疫反應(yīng)。將成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞分別分成4-5個(gè)不同的亞簇，然后根據(jù)不同生物學(xué)的過程和不同的標(biāo)記基因進(jìn)行分類。此外，它揭示m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子可能與CRC的臨床和生物學(xué)特征以及主要TME細(xì)胞類型的擬時(shí)間軌跡有顯著關(guān)系。批量測(cè)序分析表明，這些m6A介導(dǎo)的TME細(xì)胞亞群對(duì)CRC患者具有顯著的預(yù)后價(jià)值，特別是對(duì)接受ICB治療的患者具有顯著的免疫應(yīng)答。
結(jié)論
       總之，作者的研究首次揭曉了m6A甲基化介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞間通訊在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)過程中的作用。
       本研究于2022年5月發(fā)表于《Journal of Translational Medicine》上，IF=7.4。
技術(shù)路線

結(jié)果
1、m6A調(diào)節(jié)因子在CRC TME細(xì)胞中的景觀
       總體而言，CRC的scRNA-seq數(shù)據(jù)集，如前描述的那樣，被用于探索m6A RNA甲基化調(diào)控子景觀（圖1A）。SMC數(shù)據(jù)集包含來自23位CRC患者的33個(gè)樣本中的65362個(gè)TME細(xì)胞，其中標(biāo)注了主要細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞（圖1B）。細(xì)胞通訊分析展示了這些細(xì)胞類型之間存在多種不同的相互作用（圖1C）。在這里，作者利用Seurat的Average Expression函數(shù)，充分評(píng)估了m6A調(diào)節(jié)因子的平均RNA表達(dá)與CRC樣本中常見變量之間的顯著差異，例如類別類型（正常vs腫瘤），MSI狀態(tài)（MSI-H vs. MSS），年齡組（Old >60 vs young <=60歲），AJCC分期（I、IIA、IIIA、IIIB、IIIC和IVA）和性別（女性）。顯然，SMC數(shù)據(jù)集中CRC的六種細(xì)胞類型中m6A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)確實(shí)不同（圖1E）。熱圖也顯示了m6A調(diào)節(jié)因子在33個(gè)CRC樣本中主要細(xì)胞類型百分比的差異表達(dá)（圖S1A）。而且，為評(píng)估m(xù)6A調(diào)節(jié)因子與TME細(xì)胞免疫狀態(tài)的關(guān)系，作者使用“estimate”R包，評(píng)估了65362例CRC TME細(xì)胞的ImmuneScore。在6中TME細(xì)胞類型中，作者使用ImmuneScore發(fā)現(xiàn)寫入器和擦除器調(diào)節(jié)因子之間存在不同的強(qiáng)關(guān)聯(lián)（圖S1B）。
       最后，圖1F分別利用scRNA數(shù)據(jù)中23個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，顯示了感興趣的四種細(xì)胞類型（成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞）的m6A特殊NMF簇的比例。

圖1 m6A RNA甲基化調(diào)控因子在結(jié)直腸癌單細(xì)胞數(shù)據(jù)中的概述

圖S1

2、新型m6A介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞有助于CRC的TME
       CRC數(shù)據(jù)集中的機(jī)制細(xì)胞可分為CRC腫瘤和正常組織中的成纖維細(xì)胞和非成纖維細(xì)胞（圖S2A）。作者將TCGA-COAD和TCGA-READ合并為一個(gè)數(shù)據(jù)集，使用xCell算法計(jì)算成纖維細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)情況，它們的高豐度表明CRC患者預(yù)后較差（圖S2C）。同樣，擬時(shí)間分析顯示，m6A RNA調(diào)節(jié)因子在TME細(xì)胞（包括成纖維細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等）的軌跡過程中起著關(guān)鍵作用（圖2A，圖S2D, S3）。因此，通過細(xì)胞通訊分析，作者發(fā)現(xiàn)這些m6A相關(guān)的成纖維細(xì)胞簇（命名為核不均一核糖核蛋白A2B1+CAF-C1（n=1939）），WTAP+CAF-C2（n=245），HNRNPC+CAF-C3（n=1194）和NoneMethy-CAF-C4（n=84）與上皮細(xì)胞之間存在不同數(shù)量的配體受體鏈接（圖2B，圖S2E）。其中，WTAP+CAF-C2群體在腫瘤樣本（n=1501）中的比例高于正常樣本（n=1961 ,卡方檢驗(yàn)p < 0.001）（圖2C）。KEGG富集分析顯示，WTAP+CAF-C2細(xì)胞群表現(xiàn)出IL-17活性、TNF信號(hào)和基于DEGs的中性粒細(xì)胞相關(guān)功能。作者還計(jì)算了來自先前研究的Pan-CAF簽名，發(fā)現(xiàn)WTAP+CAF-C2評(píng)分與炎性CAF（paniCAF）密切相關(guān)（圖2E）。
       基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析顯示，26個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的表達(dá)在4個(gè)聚類中存在顯著差異。值得注意的屙屎，REL的TFs，CEBPB、FOSL1、POU2F2、NFKB1、IRF1和ETS1在WTAP+CAF-C2簇中上調(diào)（圖2F）。作者還比較了四種m6A介導(dǎo)的CAF中一些表面蛋白基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD34、LRRN3、BAMB1、P2RY6、CLDN1和ICAM1在大鼠WTAP+CAF-C2組中升高（圖S2F）。從途徑熱圖可以看出，WTAP+CAFC2和NoneMethy-CAF-C4在這些途徑基因的表達(dá)上存在顯著差異。最后，富集圖譜顯示HNRNPA2B1+CAF-C1、WTAP+CAF-C2和NoneMethy-CAF-C4具有不同的REACTOME通路特征（圖2H）。

圖2 m6A調(diào)節(jié)因子改變成成纖維細(xì)胞的特征

圖S2

圖S3：偽時(shí)間軌跡分析熱圖，結(jié)直腸癌TME主要細(xì)胞類型中的TME細(xì)胞亞型包括巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞以及四種T細(xì)胞（CD8+T、CD4+T、Treg、NK）

T細(xì)胞）。

3、m6A介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的經(jīng)典特征
       骨髓細(xì)胞共提取巨噬細(xì)胞5822個(gè)，分為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（5586個(gè)）和正常巨噬細(xì)胞（236個(gè)）（圖S4A）。然后，作者獲得5個(gè)主要的m6A-mac集群（圖S4B, C），包含4個(gè)集群表達(dá)m6A調(diào)節(jié)因子（WATP+mac-C1，n=1432；HNRNPC+mac-C2，n=442）和一個(gè)不表達(dá)m6A調(diào)控因子的集群（NoneMethy-mac-C5，n=241）（圖3A）。m6A-mac NMF簇的平均數(shù)量和細(xì)胞比例在正常和腫瘤之間有顯著差異（卡方檢驗(yàn)p < 0.001，圖S4D）。與成纖維細(xì)胞類似，作者也觀察到這些m6A相關(guān)巨噬細(xì)胞簇與腫瘤上皮細(xì)胞之間存在不同數(shù)量的配體受體連接。
       接下來，對(duì)這些signatures使用Seurat的AddModulScore函數(shù)（圖3B,C，圖S4E, F），在TAMs中，作者發(fā)現(xiàn)WTAP+macC1與促炎巨噬細(xì)胞顯著相關(guān)，HNRNPA2B1+mac-C3與SPP1+和C1q+巨噬細(xì)胞顯著相關(guān)。檢查點(diǎn)在5個(gè)m6A-mac集群中的表達(dá)也有顯著差異（圖S4G）。此外，巨噬細(xì)胞的SCENIC分析顯示，WTAP+mac-C1和HNRNPA2B1+mac-C3簇對(duì)潛在TF的激活不同（圖3D）。
       為評(píng)估作者的m6A-mac集群和特殊途徑之間的關(guān)系，作者使用GSVA，檢測(cè)到113個(gè)代謝途徑仲有1個(gè)在5個(gè)m6A-mac集群之間存在顯著差異（圖3E）。然后，50個(gè)標(biāo)志通路在5個(gè)集群通路中顯示出廣泛不同的活動(dòng)（圖S4H）。富集圖還顯示W(wǎng)TAP+mac-C1、HNRNPA2B1+mac-C3和TTHDC1 & YTHDF3+mac-C4具有不同的REACTOME通路特征（圖3F）。

圖3 m6A調(diào)節(jié)因子有助于5822腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生

圖S4：CRC中m6A-mac集群的特性

4、m6A介導(dǎo)的T/B細(xì)胞表型強(qiáng)調(diào)CRC的抗腫瘤免疫應(yīng)答
       總共檢測(cè)到23115個(gè)T細(xì)胞，鑒定到CD4+、CD8+、Treg、NK、T helper 17、T follicular helper等8種主要細(xì)胞類型并進(jìn)一步分析（圖4A）。NMF算法共識(shí)別出5個(gè)與m6A相關(guān)的細(xì)胞簇，命名為methy-T-C1至methy-T-C1（圖4B），這些m6A相關(guān)的T細(xì)胞簇與腫瘤上皮細(xì)胞之間存在不同數(shù)量的配體受體連接（圖4C）。檢查點(diǎn)表達(dá)分析也顯示這些m6A相關(guān)T細(xì)胞簇之間的表達(dá)有顯著差異（圖S5A）。網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析顯示，TFs在這些m6A T細(xì)胞簇中的表達(dá)存在顯著差異（圖4D）。此外，為評(píng)估T細(xì)胞中與m6A相關(guān)的T細(xì)胞簇，作者發(fā)現(xiàn)共刺激、共抑制免疫基因和一些功能相關(guān)標(biāo)記物的平均表達(dá)存在許多差異。作者還發(fā)現(xiàn)CD4+T、CD8+T、Treg和NK T細(xì)胞的m6A細(xì)胞簇中特征的平均表達(dá)存在許多差異，包括T衰竭評(píng)分、T細(xì)胞毒性評(píng)分、T效應(yīng)評(píng)分和T逃避評(píng)分（圖4E）。同樣，根據(jù)差異表達(dá)基因（DEGs），富集圖譜顯示CD8+T-C1、Treg-C1、CD8+T-C4和Treg-C4有更多的免疫功能相關(guān)條目（圖S5B）。對(duì)于9146個(gè)B細(xì)胞，NMF m6A簇與上皮細(xì)胞具有相似的配體受體連接。M6A相關(guān)B細(xì)胞組分別與IgG漿B細(xì)胞、IgA+漿B細(xì)胞、CD19+CD20+B細(xì)胞無顯著關(guān)系（圖4F-H）。然而，熱圖仍然顯示了m6A集群之間顯著不同的TFs（圖4I）。

圖4 T細(xì)胞和B細(xì)胞m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的NMF簇

圖S5：結(jié)直腸癌中m6A-T細(xì)胞群的免疫特征及預(yù)后

5、m6A介導(dǎo)的TME模式有助于結(jié)直腸癌的預(yù)后和免疫治療
       為獲得主要CRC TME細(xì)胞類型的特征，作者重新計(jì)算了它們?cè)贑RC scRNA數(shù)據(jù)中的DEGs，并提取了前30個(gè)作為細(xì)胞標(biāo)記。然后，根據(jù)m6A介導(dǎo)的TME細(xì)胞的所有DEGs，作者使用GSVA計(jì)算m6A亞評(píng)分，并通過對(duì)來自8個(gè)和11個(gè)CRC隊(duì)列的1892例和2315例CRC患者的OS和RFS進(jìn)行meta分析，分別探討其在CRC患者和泛癌中的預(yù)后，如圖5所示。將所有評(píng)分分為兩組進(jìn)行cox回歸分析。有趣的是，隨著特殊m6A介導(dǎo)的亞細(xì)胞類型中主導(dǎo)m6A基因的變化，作者發(fā)現(xiàn)它們的無復(fù)發(fā)生存期（圖5A）和總生存率（圖5B）在這些亞群中有顯著差異，包括CAF、巨噬細(xì)胞、CD8+T、Treg和B細(xì)胞。此外，作者使用邏輯回歸方法觀察m6A sub TME細(xì)胞的相同有意義的現(xiàn)象，以預(yù)測(cè)13個(gè)公共癌癥隊(duì)列（腎透明細(xì)胞癌，非小細(xì)胞肺癌，惡性黑色素瘤，黑色素瘤，尿路上皮癌和膀胱癌）中經(jīng)歷過免疫治療的病人的免疫反應(yīng)（圖5C）。最后，作者考察了附加文件2：圖S6A和B中列出的泛癌癥患者中m6A亞簇的預(yù)后，發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞亞簇貢獻(xiàn)了不同的癌癥，具有顯著的預(yù)后。

圖5 m6A相關(guān)細(xì)胞類型（GSVA評(píng)分）的總體預(yù)后和免疫治療反應(yīng)，來源于公共隊(duì)列的大容量序列。采用survival R包計(jì)算cut-off值

圖S6：Pan癌癥患者中m6A相關(guān)亞型TME細(xì)胞預(yù)后的動(dòng)態(tài)影響

6、m6A介導(dǎo)的TME模式增強(qiáng)了細(xì)胞間通訊
       通過細(xì)胞通訊分析，作者列出了細(xì)胞間通信的所有配體-受體對(duì)，包括MIF?（CD74+CXCR4）、MIF?（CD74+CD44）、MDK-NCL、LGALS9?CD45, CLEC2D?KLRB1、CLEC2C?KLRB1、CLEC2B?KLRB1、APP?CD74、CD99?CD99和ADGRE5?CD55，從m6A亞簇到腫瘤上皮細(xì)胞均存在（圖6A）。在這里，圖6B證明了兩者之間潛在機(jī)制的假設(shè)。每種m6A亞型可能與腫瘤上皮簇具有不同的強(qiáng)度和配體受體對(duì)，這表明m6A介導(dǎo)的TME細(xì)胞可能與腫瘤細(xì)胞有更多的相互作用，從而促進(jìn)CRC的進(jìn)展。

圖6 從主要的m6A相關(guān)TME細(xì)胞到上皮細(xì)胞的細(xì)胞間通訊

實(shí)驗(yàn)方法
scRNA-seq，TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫挖掘， Seurat 包可視化CRC中TME細(xì)胞類型和細(xì)胞亞型，TME細(xì)胞m6A mRNA調(diào)控因子的擬時(shí)間軌跡分析，TME細(xì)胞中m6A mRNA調(diào)控因子的非負(fù)性基質(zhì)因子分解，TME細(xì)胞中m6A相關(guān)細(xì)胞亞型標(biāo)記基因的鑒定，KEGG和Reactome通路分析（clusterProfiler R包），GSVA，SCENIC分析，細(xì)胞通訊分析，m6A相關(guān)特征的生存分析
參考文獻(xiàn)
Gao Y, Wang H, Chen S, An R, Chu Y, Li G, Wang Y, Xie X, Zhang J. Single-cell N6-methyladenosine regulator patterns guide intercellular communication of tumor microenvironment that contribute to colorectal cancer progression and immunotherapy. J Transl Med. 2022 May 4;20（1）:197. doi: 10.1186/s12967-022-03395-7. PMID: 35509079; PMCID: PMC9066909.
關(guān)鍵詞
單細(xì)胞，m6A，腫瘤微環(huán)境，結(jié)直腸癌，預(yù)后，免疫治療