天然多酚激活并增強(qiáng)GPX4以減輕淀粉樣蛋白β誘導(dǎo)的阿爾茨海默病鐵死亡

       阿爾茨海默?。ˋD）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，也是最常見(jiàn)的癡呆形式，其特征是記憶力和認(rèn)知功能的進(jìn)行性下降。盡管研究取得了重大進(jìn)展，但對(duì)其病因的了解仍然有限。鐵死亡是一種鐵調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡方式，近年來(lái)因其參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展而在病因?qū)W研究和治療方面受到關(guān)注。細(xì)胞內(nèi)鐵水平是鐵死亡的關(guān)鍵因素。鐵還作為特異性脂氧合酶的輔因子促進(jìn)酶促脂質(zhì)過(guò)氧化。然而，啟動(dòng)鐵死亡的鐵濃度閾值仍不明確。線粒體功能障礙、脂質(zhì)過(guò)氧化以及抗氧化酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）活性和水平的降低與鐵死亡相關(guān)。雖然鐵死亡正在被探索作為一種消滅腫瘤的治療途徑，但已發(fā)現(xiàn)它在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮拮抗作用，包括AD。目前還需要開(kāi)發(fā)同時(shí)靶向鐵死亡和AD的多功能分子，并協(xié)同增強(qiáng)和激活包括GPX4在內(nèi)的天然抗氧化機(jī)制，以減輕AD中鐵死亡的復(fù)雜病理。該研究發(fā)表在《Chemical Science》，IF：9.825。
技術(shù)路線

圖1 機(jī)制圖

主要研究結(jié)果
1. 多酚（PPs）的鐵結(jié)合作用
       鐵死亡是一種鐵依賴的細(xì)胞死亡方式，鐵螯合劑被認(rèn)為是一種有前景的鐵死亡抑制劑。評(píng)估了一組主要含有兒茶酚和沒(méi)食子酸酯部分的PPs的鐵螯合能力。篩選的PPs包括沒(méi)食子酸（GA）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、鞣酸（TA）、鞣花酸（EA）、染料木黃酮（GEN）、丁香酸（SA）、沒(méi)食子酸甲酯（MeG）、4-羥基黃酮（4-HF）和2-羥基黃酮（2-HF）（圖1B）。在HEPES緩沖液中使用紫外-可見(jiàn)吸收光譜測(cè)定了這些PPs與Fe³⁺的相互作用強(qiáng)度。在加入FeCl3后，PPs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜顯示吸光度增加，其中TA增加最大（圖2A）。將數(shù)據(jù)擬合為Benesi-Hildebrand方程，以確定結(jié)合常數(shù)（K_B）。TA含有5個(gè)沒(méi)食子酸，表現(xiàn)出最高的鐵螯合能力，其K_B值為6.64 ×10⁵ M^?1，而EGCG和GA的KB值分別為5.1×10⁵ M^?1和4.2×10³ M^?1（圖2B）。研究者發(fā)現(xiàn)MeG，GEN，EA和2-HF的結(jié)合常數(shù)遠(yuǎn)低于TA。

圖2 PPs的鐵螯合和抗氧化研究

2. 抗氧化作用和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化
       采用α-二苯基-β-苦?；拢―PPH）、ABTS 和抗壞血酸鐵實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)強(qiáng)鐵螯合劑TA和EGCG以及GA的抗氧化活性。通過(guò)在PBS緩沖液和FeCl3中使用鐵抗壞血酸測(cè)定來(lái)評(píng)估PPs對(duì)氧化還原沉默F(xiàn)e³⁺和猝滅過(guò)量ROS的能力（圖2C）。TA在452nm處以濃度依賴性的方式降低了發(fā)射，表明它能捕獲Fe³⁺并穩(wěn)定氧化還原休眠狀態(tài)，并清除自由基（圖2D）。在最高濃度20μM時(shí)，TA對(duì)ROS的猝滅率為80%。有趣的是，在Aβ₄₂存在的情況下進(jìn)行的模擬AD條件的類似實(shí)驗(yàn)表明，TA可以有效結(jié)合并阻止Fe³⁺氧化還原過(guò)程，從而猝滅ROS的產(chǎn)生（圖2E）。研究者使用Fe²⁺+H₂O₂氧化還原體系來(lái)評(píng)估PPs對(duì)牛血清白蛋白氧化的保護(hù)作用，該體系在原位產(chǎn)生ROS，并模擬類似鐵死亡的鐵介導(dǎo)的氧化應(yīng)激環(huán)境。TA和EGCG處理分別減少了30%和35%的蛋白質(zhì)氧化（圖2F）。
       接下來(lái)，研究者使用α-磷脂酰膽堿作為模型脂質(zhì)和Fe²⁺+H₂O₂氧化還原體系進(jìn)行了脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定，以測(cè)量鐵死亡條件下的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。以Fe²⁺+H₂O₂對(duì)α-磷脂酰膽堿的過(guò)氧化作用作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)TA和EGCG對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化作用的抑制率分別為42%和40%（圖2G）。在TA和EGCG存在的情況下，脂質(zhì)過(guò)氧化的濃度依賴性圖顯示了它們出色的過(guò)氧化抑制活性，這可以歸因于它們的協(xié)同鐵螯合和自由基捕獲機(jī)制（圖2H）。
3. 鐵非依賴性和依賴性Aβ₄₂和tau蛋白聚集的調(diào)節(jié)
       研究者評(píng)估了PPs調(diào)節(jié)Aβ₄₂鐵非依賴性和依賴性聚集傾向的能力聚集依賴性硫黃素T（ThT）熒光數(shù)據(jù)顯示，在所有PPs中，EGCG和TA表現(xiàn)出優(yōu)越的活性，在濃度為20μM時(shí)，聚集抑制率分別為44%和35%（圖3A）。Aβ₄₂的聚集滯后時(shí)間（Tlag）為9.2h，一級(jí)聚集速率常數(shù)（κ）為0.51 h^?1。TA和EGCG濃度的增加增加了Tlag，降低了κ，表明Aβ₄₂聚集顯著延遲（圖3B）。當(dāng)Aβ₄₂∶PP為1∶5時(shí)，EGCG的抑制率（95%）明顯高于TA（82%）。由于鐵穩(wěn)態(tài)在AD病因?qū)W中的關(guān)鍵作用，研究者研究了鐵對(duì)Aβ₄₂聚集的影響。與原始Aβ₄₂相比，F(xiàn)e³⁺ 1:1的Aβ₄₂使Tlag下降至8.72 h，而κ從0.51 h^?1增加至0.72 h^?1（圖3C）。在1:5比例下，TA和EGCG的Tlag值分別為10.12 h和10.9 h，κ值分別為0.20 h^?1和0.17 h^?1（圖3D）。
       使用ThT熒光動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)PPs調(diào)節(jié)花生四烯酸誘導(dǎo)的tau聚集的能力（圖3E）。EGCG和TA在濃度為20μM時(shí)，對(duì)細(xì)胞的聚集抑制率分別為53%和46%。TA和EGCG表現(xiàn)出濃度依賴性的活性，在1:5的比例下，抑制率最高，分別為70%和81%，在2.5小時(shí)之后，沒(méi)有觀察到ThT熒光進(jìn)一步增加（圖3F）。

圖3 篩選PPs抑制Aβ的能力42并使用ThT測(cè)定監(jiān)測(cè)tau聚集

4. GPX4的激活及其RSL3誘導(dǎo)的抑制的逆轉(zhuǎn)
       GPX4缺乏增加了細(xì)胞對(duì)鐵死亡的易感性。GPX4有兩個(gè)不同的位點(diǎn)：底物結(jié)合位點(diǎn)和變構(gòu)位點(diǎn)。與抑制劑位點(diǎn)結(jié)合的小分子可作為抑制劑，而與激活位點(diǎn)結(jié)合預(yù)計(jì)可增強(qiáng)GPX4活性（圖4A）。TA與GPX4的激活位點(diǎn)結(jié)合，而EGCG與GPX4的激活位點(diǎn)或抑制位點(diǎn)不一致。研究者對(duì)GPX4抑制劑RSL3和GPX4激活劑PKUMDL-LC-102進(jìn)行了對(duì)接研究（圖4A）。結(jié)果表明，RSL3與抑制位點(diǎn)結(jié)合，而PKUMDL-LC-102與激活位點(diǎn)結(jié)合，類似于TA。在變構(gòu)激活位點(diǎn)，GPX4激活劑PKUMDL-LC-102被酸性殘基D21和D23以及極性殘基V98、F100和M102包圍（圖4A）。
       使用GPX4抑制劑篩選試劑盒評(píng)估TA對(duì)GPX4活性的影響。在該實(shí)驗(yàn)中，研究者利用GPX4對(duì)NADPH的消耗來(lái)監(jiān)測(cè)酶的活性。GPX4與RSL3孵育60分鐘可抑制GPX4活性22%。然而，在20μM的濃度下，TA和EGCG能夠分別逆轉(zhuǎn)RSL3誘導(dǎo)的抑制作用12.3%和9.5%（圖4B）。TA通過(guò)結(jié)合GPX4的激活位點(diǎn)來(lái)增加GPX4的活性。通過(guò)監(jiān)測(cè)RSL3對(duì)GPX4活性的濃度依賴性抑制，研究者計(jì)算出了RSL3的半最大抑制濃度（IC50）值，結(jié)果為17.17±0.17μM（圖4C，D）。RSL3的IC50值是在TA存在的情況下獨(dú)立計(jì)算的。在反應(yīng)混合物中加入20 μM的TA將RSL3的IC50值從17.17±0.17μM調(diào)節(jié)到29.98±1.09μM，表明TA可以降低RSL3誘導(dǎo)的GPX4抑制（圖4E，F(xiàn)）。EGCG在RSL3誘導(dǎo)的GPX4抑制后顯示出相對(duì)較低的恢復(fù)內(nèi)在酶活性的能力，將IC50值改變?yōu)?1.01±0.47μM（圖5B）。對(duì)接結(jié)果表明TA具有與GPX4激活位點(diǎn)結(jié)合的能力。再加上TA可以有效逆轉(zhuǎn)RSL3誘導(dǎo)的GPX4抑制，因此研究者研究TA是否可以直接作為GPX4激活劑發(fā)揮作用。研究者的數(shù)據(jù)表明，用TA處理GPX4導(dǎo)致酶活性的濃度依賴性增加。在100 μM TA濃度下，觀察到GPX4活性增強(qiáng)了19%（圖4G）。這些結(jié)果表明，TA不僅可以從RSL3誘導(dǎo)的抑制中恢復(fù)GPX4的活性，而且還可以增強(qiáng)其內(nèi)在活性。所有體外實(shí)驗(yàn)的綜合分析確定TA是最有希望的抗鐵死亡候選藥物。這主要是因?yàn)樗軌蚣せ頖PX4并伴有多功能活性。相比之下，EGCG顯示出更好的抗淀粉樣蛋白和tau蛋白特性。

圖4 GPX4在小分子與抑制劑和激活劑位點(diǎn)結(jié)合的情況下的酶活性

5. 挽救鐵死亡誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡
       培養(yǎng)48h后，采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)鉛PPs對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。為了確定TA和EGCG抑制鐵死亡的能力，研究者將SH-SY5Y細(xì)胞分為RSL3單獨(dú)處理組和TA和EGCG聯(lián)合處理組。培養(yǎng)48h后，RSL3處理組細(xì)胞存活率為46%，而未處理組細(xì)胞存活率為100%。值得注意的是，TA和EGCG以濃度依賴性的方式拯救神經(jīng)元細(xì)胞，在濃度為20μM時(shí)，細(xì)胞存活率分別達(dá)到84%和62%（圖5A，B）。研究者進(jìn)行了TA與Ferrostatin-1和DFO的比較研究，以研究RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡的拯救能力。Ferrostatin-1在10μM的低濃度下幾乎能100%抑制鐵死亡。TA挽救RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的效果與較低濃度的Ferrostatin-1相當(dāng)。另一方面，盡管DFO具有比TA更強(qiáng)的鐵螯合能力，但在一定濃度下，DFO并未表現(xiàn)出顯著的拯救鐵死亡損傷的作用。采用免疫熒光法檢測(cè)RSL3單獨(dú)處理以及TA和EGCG聯(lián)合處理后細(xì)胞中GPX4的水平。與健康細(xì)胞相比，RSL3處理24 h可將GPX4水平降低至83%。值得注意的是，TA和EGCG處理使RSL3處理的細(xì)胞中的GPX4水平分別恢復(fù)至96%和91%，表明細(xì)胞從鐵死亡中恢復(fù)（圖5D）。此外，為了驗(yàn)證這些結(jié)果，研究者使用了蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)定量GPX4的水平。與對(duì)照細(xì)胞相比，RSL3處理后GPX4水平降低至73%（圖5E、F）。值得注意的是，經(jīng)TA治療后GPX4水平完全恢復(fù)。
       LIP升高是鐵死亡的標(biāo)志，可催化脂質(zhì)過(guò)氧化并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用鈣黃綠素-乙酰氧基甲酯染色檢測(cè)RSL3單獨(dú)處理、TA和EGCG聯(lián)合處理的細(xì)胞LIP。鈣黃綠素-乙酰氧基甲酯在細(xì)胞內(nèi)被酯酶裂解，在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生鈣黃綠素?zé)晒鈭F(tuán)，表現(xiàn)出高熒光。然而，當(dāng)鈣黃綠素與LIP螯合時(shí)，其熒光被猝滅，從而可以估算游離LIP水平。與健康細(xì)胞相比，RSL3處理的細(xì)胞顯示細(xì)胞內(nèi)Fe水平增加，相應(yīng)的鈣黃綠素?zé)晒饨档椭?7%（圖5G-K）。值得注意的是，50μM TA和EGCG處理降低了LIP水平，導(dǎo)致鈣黃綠素?zé)晒夥謩e增加約95%和100%，與對(duì)照細(xì)胞相似（圖5L）。這種作用呈劑量依賴性，表明TA和EGCG能夠隔離游離Fe并使其失活。鐵死亡觸發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，增加ROS生成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS水平升高和線粒體膜電位（MMP）下降，導(dǎo)致線粒體碎片化。研究者使用MitoSOX探針監(jiān)測(cè)細(xì)胞中線粒體ROS水平。RSL3處理使線粒體ROS水平增加到148%，與健康細(xì)胞相比。相反，TA和EGCG分別將RSL3處理的細(xì)胞中的ROS水平降低至95%和91%，表明它們有能力預(yù)防鐵死亡ROS介導(dǎo)的線粒體損傷（圖5M）。通過(guò)探針檢測(cè)MMP的變化，證實(shí)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡和PP處理的逆轉(zhuǎn)。RSL3處理細(xì)胞后，MMP下降至76%，與正常細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，TA和EGCG處理分別將MMP恢復(fù)至93%和95%，表明對(duì)功能性線粒體損傷有預(yù)防作用（圖5N）。采用Mito-TG.45染色法檢測(cè)TA和EGCG對(duì)鐵死亡細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷的保護(hù)作用采用活細(xì)胞熒光顯微鏡觀察RSL3單獨(dú)處理或TA和EGCG聯(lián)合處理的細(xì)胞。值得注意的是，經(jīng)TA和EGCG處理的細(xì)胞保持了健康的管狀結(jié)構(gòu)，支持這些PPs對(duì)鐵死亡線粒體損傷的保護(hù)作用，ROS和MMP研究證明了這一點(diǎn)（圖5R，S）。

圖5 細(xì)胞研究表明TA和EGCG能夠從鐵死亡和Aβ中拯救神經(jīng)元細(xì)胞42-誘導(dǎo)毒性

6. 從淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的鐵死亡中拯救神經(jīng)元細(xì)胞
       TA和EGCG調(diào)節(jié)Aβ₄₂聚集的有效性促使研究者研究它們拯救神經(jīng)細(xì)胞免受Aβ₄₂誘導(dǎo)的毒性的能力。分別用Aβ₄₂、TA和EGCG處理SH-SY5Y細(xì)胞。Aβ₄₂處理細(xì)胞30h后，細(xì)胞存活率為34.8%，與未處理的對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，在PPs存在的情況下，研究者觀察到Aβ42處理的神經(jīng)元細(xì)胞以劑量依賴性的方式得到挽救，最高濃度的TA和EGCG分別使細(xì)胞存活率提高到63%和69%（圖5T）。在AD的鐵死亡背景下，鐵加速毒性淀粉樣蛋白（Aβ₄₂-Fe）纖維的積累，產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致膜損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化。研究者使用MTT法檢測(cè)TA和EGCG調(diào)節(jié)毒性Aβ₄₂ + Fe聚集和拯救神經(jīng)元細(xì)胞免于Aβ₄₂ + Fe誘導(dǎo)的鐵死亡的能力。Aβ₄₂: Fe（1: 5）處理組細(xì)胞存活率為17%，對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%。然而，用TA和EGCG處理后，Aβ₄₂ + Fe處理的細(xì)胞存活率分別提高到74%和77%，呈劑量依賴性（圖5U，V）。將細(xì)胞分為Aβ₄₂ + Fe組和TA + EGCG組，DCFDA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平；Aβ₄₂ + Fe（1:5）培養(yǎng)6h后，細(xì)胞內(nèi)ROS由未處理組的31%增加至100%。然而，TA和EGCG處理后，Aβ₄₂ + Fe處理細(xì)胞中的ROS水平分別降低至36%和38%，表明它們具有復(fù)合體和使Fe氧化還原失去活性、調(diào)節(jié)Aβ₄₂ - Fe fenton型反應(yīng)并最終阻止ROS生成的能力（圖50）。這些細(xì)胞研究有力地支持TA和EGCG能夠減輕RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡和Aβ₄₂ - Fe相關(guān)毒性，使它們成為協(xié)同靶向鐵死亡和AD的潛在候選藥物。結(jié)合ThT研究，研究者評(píng)估了TA保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受tau誘導(dǎo)的毒性的能力。在AA誘導(dǎo)的tau聚集物存在下，與健康細(xì)胞相比，細(xì)胞活力降低至47%（圖5W）。TA可以劑量依賴性地增加細(xì)胞活力，將細(xì)胞活力提高到100%。
       為了證實(shí)Aβ₄₂與鐵死亡之間的關(guān)系，研究者采用免疫熒光法檢測(cè)Aβ₄₂ + Fe單獨(dú)孵育以及TA和EGCG共同孵育的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞株中GPX4的水平。與健康細(xì)胞相比，Aβ₄₂ + Fe（1:5）處理細(xì)胞30小時(shí)顯著降低GPX4水平至65%（圖6）。據(jù)研究者所知，這是第一個(gè)在鐵死亡背景下的神經(jīng)細(xì)胞中Aβ₄₂ + Fe和GPX4水平直接相關(guān)的報(bào)告，通過(guò)直接定量蛋白水平的免疫熒光測(cè)定確定。與未處理的對(duì)照細(xì)胞相比，TA顯著增加了Aβ₄₂ + Fe處理的細(xì)胞GPX4水平（147%），表明TA可以在AD病理?xiàng)l件下提高GPX4水平。

圖6 通過(guò)免疫熒光（IF）測(cè)定進(jìn)行蛋白質(zhì)定量

       這些發(fā)現(xiàn)促使研究者在神經(jīng)元細(xì)胞中檢測(cè)TA作為GPX4增強(qiáng)子的作用。研究者觀察到，與未處理的細(xì)胞相比，TA處理的細(xì)胞內(nèi)GPX4水平增加到192%（圖7A，B）。TA不僅增強(qiáng)GPX4活性，而且增加其在細(xì)胞中的水平。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)GPX4蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與未處理的細(xì)胞相比，TA處理使GPX4水平增加到127%（圖7C，D）。基于這些發(fā)現(xiàn)，研究者檢測(cè)了抗氧化主要調(diào)節(jié)因子核因子e2相關(guān)因子2（Nrf2）的變化，已知Nrf2可直接和間接調(diào)節(jié)GPX4及其相關(guān)抗氧化蛋白46雖然有報(bào)道表明TA能夠激活Nrf2通路，但研究者評(píng)估了在神經(jīng)細(xì)胞中TA處理后Nrf2的激活。研究表明，TA處理導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞中Nrf2積累和核轉(zhuǎn)位。與未處理的細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)Nrf2水平增加到148%，并且使用TA處理后，來(lái)自細(xì)胞質(zhì)的Nrf2蛋白發(fā)生了2倍的核易位（圖7E-G）。因此，研究者推測(cè)TA可能通過(guò)Nrf2-GPX4軸提高GPX4水平。

圖7 通過(guò)IF測(cè)定和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行蛋白質(zhì)定量

結(jié)論
       該研究發(fā)現(xiàn)天然的TA是一種高效的鐵死亡抑制劑。它通過(guò)鐵螯合、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、拯救線粒體損傷和激活Nrf2-GPX4軸等鐵死亡的所有主要途徑發(fā)揮作用，從而提高它們的水平。同時(shí)，TA是一種有效的Aβ₄₂和tau蛋白聚集的抑制劑，有效地調(diào)節(jié)劇毒鐵誘導(dǎo)的Aβ₄₂聚集，減少氧化應(yīng)激，對(duì)抗AD患者的鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)。雖然GPX4蛋白的合成效率非常低且需要大量能量，但研究者證明了一種天然的多酚如何提供一種可行的解決方案，以協(xié)同調(diào)節(jié)鐵死亡和AD的多方面毒性，而GPX4的激活是關(guān)鍵機(jī)制之一。這可能鼓勵(lì)研究人員探索無(wú)毒的天然產(chǎn)物來(lái)解決問(wèn)題，并強(qiáng)調(diào)GPX4在有效調(diào)節(jié)鐵死亡以及闡明其在AD中的作用的重要性。

實(shí)驗(yàn)方法
ABTS抗氧化試驗(yàn)，鐵抗壞血酸測(cè)定，硫黃素T(ThT)熒光檢測(cè)，細(xì)胞培養(yǎng)和MTT法檢測(cè)，ROS測(cè)定，神經(jīng)細(xì)胞拯救實(shí)驗(yàn)，溫滴定量熱法(ITC)測(cè)量，蛋白質(zhì)印跡，免疫熒光
參考文獻(xiàn)
Baruah P, Moorthy H, Ramesh M, Padhi D, Govindaraju T. A natural polyphenol activates and enhances GPX4 to mitigate amyloid-β induced ferroptosis in Alzheimer's disease. Chem Sci. 2023 Aug 22;14(35):9427-9438. doi: 10.1039/d3sc02350h.