天然多酚激活并增強GPX4以減輕淀粉樣蛋白β誘導的阿爾茨海默病鐵死亡

       阿爾茨海默?。ˋD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，也是最常見的癡呆形式，其特征是記憶力和認知功能的進行性下降。盡管研究取得了重大進展，但對其病因的了解仍然有限。鐵死亡是一種鐵調(diào)節(jié)的細胞死亡方式，近年來因其參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展而在病因?qū)W研究和治療方面受到關(guān)注。細胞內(nèi)鐵水平是鐵死亡的關(guān)鍵因素。鐵還作為特異性脂氧合酶的輔因子促進酶促脂質(zhì)過氧化。然而，啟動鐵死亡的鐵濃度閾值仍不明確。線粒體功能障礙、脂質(zhì)過氧化以及抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）活性和水平的降低與鐵死亡相關(guān)。雖然鐵死亡正在被探索作為一種消滅腫瘤的治療途徑，但已發(fā)現(xiàn)它在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮拮抗作用，包括AD。目前還需要開發(fā)同時靶向鐵死亡和AD的多功能分子，并協(xié)同增強和激活包括GPX4在內(nèi)的天然抗氧化機制，以減輕AD中鐵死亡的復雜病理。該研究發(fā)表在《Chemical Science》，IF：9.825。
技術(shù)路線

圖1 機制圖

主要研究結(jié)果
1. 多酚（PPs）的鐵結(jié)合作用
       鐵死亡是一種鐵依賴的細胞死亡方式，鐵螯合劑被認為是一種有前景的鐵死亡抑制劑。評估了一組主要含有兒茶酚和沒食子酸酯部分的PPs的鐵螯合能力。篩選的PPs包括沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、鞣酸（TA）、鞣花酸（EA）、染料木黃酮（GEN）、丁香酸（SA）、沒食子酸甲酯（MeG）、4-羥基黃酮（4-HF）和2-羥基黃酮（2-HF）（圖1B）。在HEPES緩沖液中使用紫外-可見吸收光譜測定了這些PPs與Fe³⁺的相互作用強度。在加入FeCl3后，PPs的紫外-可見吸收光譜顯示吸光度增加，其中TA增加最大（圖2A）。將數(shù)據(jù)擬合為Benesi-Hildebrand方程，以確定結(jié)合常數(shù)（K_B）。TA含有5個沒食子酸，表現(xiàn)出最高的鐵螯合能力，其K_B值為6.64 ×10⁵ M^?1，而EGCG和GA的KB值分別為5.1×10⁵ M^?1和4.2×10³ M^?1（圖2B）。研究者發(fā)現(xiàn)MeG，GEN，EA和2-HF的結(jié)合常數(shù)遠低于TA。

圖2 PPs的鐵螯合和抗氧化研究

2. 抗氧化作用和抑制脂質(zhì)過氧化
       采用α-二苯基-β-苦?；拢―PPH）、ABTS 和抗壞血酸鐵實驗評價強鐵螯合劑TA和EGCG以及GA的抗氧化活性。通過在PBS緩沖液和FeCl3中使用鐵抗壞血酸測定來評估PPs對氧化還原沉默F(xiàn)e³⁺和猝滅過量ROS的能力（圖2C）。TA在452nm處以濃度依賴性的方式降低了發(fā)射，表明它能捕獲Fe³⁺并穩(wěn)定氧化還原休眠狀態(tài)，并清除自由基（圖2D）。在最高濃度20μM時，TA對ROS的猝滅率為80%。有趣的是，在Aβ₄₂存在的情況下進行的模擬AD條件的類似實驗表明，TA可以有效結(jié)合并阻止Fe³⁺氧化還原過程，從而猝滅ROS的產(chǎn)生（圖2E）。研究者使用Fe²⁺+H₂O₂氧化還原體系來評估PPs對牛血清白蛋白氧化的保護作用，該體系在原位產(chǎn)生ROS，并模擬類似鐵死亡的鐵介導的氧化應激環(huán)境。TA和EGCG處理分別減少了30%和35%的蛋白質(zhì)氧化（圖2F）。
       接下來，研究者使用α-磷脂酰膽堿作為模型脂質(zhì)和Fe²⁺+H₂O₂氧化還原體系進行了脂質(zhì)過氧化測定，以測量鐵死亡條件下的脂質(zhì)過氧化程度。以Fe²⁺+H₂O₂對α-磷脂酰膽堿的過氧化作用作為對照，發(fā)現(xiàn)TA和EGCG對脂質(zhì)過氧化作用的抑制率分別為42%和40%（圖2G）。在TA和EGCG存在的情況下，脂質(zhì)過氧化的濃度依賴性圖顯示了它們出色的過氧化抑制活性，這可以歸因于它們的協(xié)同鐵螯合和自由基捕獲機制（圖2H）。
3. 鐵非依賴性和依賴性Aβ₄₂和tau蛋白聚集的調(diào)節(jié)
       研究者評估了PPs調(diào)節(jié)Aβ₄₂鐵非依賴性和依賴性聚集傾向的能力聚集依賴性硫黃素T（ThT）熒光數(shù)據(jù)顯示，在所有PPs中，EGCG和TA表現(xiàn)出優(yōu)越的活性，在濃度為20μM時，聚集抑制率分別為44%和35%（圖3A）。Aβ₄₂的聚集滯后時間（Tlag）為9.2h，一級聚集速率常數(shù)（κ）為0.51 h^?1。TA和EGCG濃度的增加增加了Tlag，降低了κ，表明Aβ₄₂聚集顯著延遲（圖3B）。當Aβ₄₂∶PP為1∶5時，EGCG的抑制率（95%）明顯高于TA（82%）。由于鐵穩(wěn)態(tài)在AD病因?qū)W中的關(guān)鍵作用，研究者研究了鐵對Aβ₄₂聚集的影響。與原始Aβ₄₂相比，F(xiàn)e³⁺ 1:1的Aβ₄₂使Tlag下降至8.72 h，而κ從0.51 h^?1增加至0.72 h^?1（圖3C）。在1:5比例下，TA和EGCG的Tlag值分別為10.12 h和10.9 h，κ值分別為0.20 h^?1和0.17 h^?1（圖3D）。
       使用ThT熒光動力學監(jiān)測PPs調(diào)節(jié)花生四烯酸誘導的tau聚集的能力（圖3E）。EGCG和TA在濃度為20μM時，對細胞的聚集抑制率分別為53%和46%。TA和EGCG表現(xiàn)出濃度依賴性的活性，在1:5的比例下，抑制率最高，分別為70%和81%，在2.5小時之后，沒有觀察到ThT熒光進一步增加（圖3F）。

圖3 篩選PPs抑制Aβ的能力42并使用ThT測定監(jiān)測tau聚集

4. GPX4的激活及其RSL3誘導的抑制的逆轉(zhuǎn)
       GPX4缺乏增加了細胞對鐵死亡的易感性。GPX4有兩個不同的位點：底物結(jié)合位點和變構(gòu)位點。與抑制劑位點結(jié)合的小分子可作為抑制劑，而與激活位點結(jié)合預計可增強GPX4活性（圖4A）。TA與GPX4的激活位點結(jié)合，而EGCG與GPX4的激活位點或抑制位點不一致。研究者對GPX4抑制劑RSL3和GPX4激活劑PKUMDL-LC-102進行了對接研究（圖4A）。結(jié)果表明，RSL3與抑制位點結(jié)合，而PKUMDL-LC-102與激活位點結(jié)合，類似于TA。在變構(gòu)激活位點，GPX4激活劑PKUMDL-LC-102被酸性殘基D21和D23以及極性殘基V98、F100和M102包圍（圖4A）。
       使用GPX4抑制劑篩選試劑盒評估TA對GPX4活性的影響。在該實驗中，研究者利用GPX4對NADPH的消耗來監(jiān)測酶的活性。GPX4與RSL3孵育60分鐘可抑制GPX4活性22%。然而，在20μM的濃度下，TA和EGCG能夠分別逆轉(zhuǎn)RSL3誘導的抑制作用12.3%和9.5%（圖4B）。TA通過結(jié)合GPX4的激活位點來增加GPX4的活性。通過監(jiān)測RSL3對GPX4活性的濃度依賴性抑制，研究者計算出了RSL3的半最大抑制濃度（IC50）值，結(jié)果為17.17±0.17μM（圖4C，D）。RSL3的IC50值是在TA存在的情況下獨立計算的。在反應混合物中加入20 μM的TA將RSL3的IC50值從17.17±0.17μM調(diào)節(jié)到29.98±1.09μM，表明TA可以降低RSL3誘導的GPX4抑制（圖4E，F(xiàn)）。EGCG在RSL3誘導的GPX4抑制后顯示出相對較低的恢復內(nèi)在酶活性的能力，將IC50值改變?yōu)?1.01±0.47μM（圖5B）。對接結(jié)果表明TA具有與GPX4激活位點結(jié)合的能力。再加上TA可以有效逆轉(zhuǎn)RSL3誘導的GPX4抑制，因此研究者研究TA是否可以直接作為GPX4激活劑發(fā)揮作用。研究者的數(shù)據(jù)表明，用TA處理GPX4導致酶活性的濃度依賴性增加。在100 μM TA濃度下，觀察到GPX4活性增強了19%（圖4G）。這些結(jié)果表明，TA不僅可以從RSL3誘導的抑制中恢復GPX4的活性，而且還可以增強其內(nèi)在活性。所有體外實驗的綜合分析確定TA是最有希望的抗鐵死亡候選藥物。這主要是因為它能夠激活GPX4并伴有多功能活性。相比之下，EGCG顯示出更好的抗淀粉樣蛋白和tau蛋白特性。

圖4 GPX4在小分子與抑制劑和激活劑位點結(jié)合的情況下的酶活性

5. 挽救鐵死亡誘導的細胞死亡
       培養(yǎng)48h后，采用噻唑藍（MTT）法檢測鉛PPs對SH-SY5Y神經(jīng)元細胞活力的影響。為了確定TA和EGCG抑制鐵死亡的能力，研究者將SH-SY5Y細胞分為RSL3單獨處理組和TA和EGCG聯(lián)合處理組。培養(yǎng)48h后，RSL3處理組細胞存活率為46%，而未處理組細胞存活率為100%。值得注意的是，TA和EGCG以濃度依賴性的方式拯救神經(jīng)元細胞，在濃度為20μM時，細胞存活率分別達到84%和62%（圖5A，B）。研究者進行了TA與Ferrostatin-1和DFO的比較研究，以研究RSL3誘導的鐵死亡的拯救能力。Ferrostatin-1在10μM的低濃度下幾乎能100%抑制鐵死亡。TA挽救RSL3誘導的細胞死亡的效果與較低濃度的Ferrostatin-1相當。另一方面，盡管DFO具有比TA更強的鐵螯合能力，但在一定濃度下，DFO并未表現(xiàn)出顯著的拯救鐵死亡損傷的作用。采用免疫熒光法檢測RSL3單獨處理以及TA和EGCG聯(lián)合處理后細胞中GPX4的水平。與健康細胞相比，RSL3處理24 h可將GPX4水平降低至83%。值得注意的是，TA和EGCG處理使RSL3處理的細胞中的GPX4水平分別恢復至96%和91%，表明細胞從鐵死亡中恢復（圖5D）。此外，為了驗證這些結(jié)果，研究者使用了蛋白質(zhì)印跡分析來定量GPX4的水平。與對照細胞相比，RSL3處理后GPX4水平降低至73%（圖5E、F）。值得注意的是，經(jīng)TA治療后GPX4水平完全恢復。
       LIP升高是鐵死亡的標志，可催化脂質(zhì)過氧化并導致細胞死亡。用鈣黃綠素-乙酰氧基甲酯染色檢測RSL3單獨處理、TA和EGCG聯(lián)合處理的細胞LIP。鈣黃綠素-乙酰氧基甲酯在細胞內(nèi)被酯酶裂解，在細胞質(zhì)中產(chǎn)生鈣黃綠素熒光團，表現(xiàn)出高熒光。然而，當鈣黃綠素與LIP螯合時，其熒光被猝滅，從而可以估算游離LIP水平。與健康細胞相比，RSL3處理的細胞顯示細胞內(nèi)Fe水平增加，相應的鈣黃綠素熒光降低至67%（圖5G-K）。值得注意的是，50μM TA和EGCG處理降低了LIP水平，導致鈣黃綠素熒光分別增加約95%和100%，與對照細胞相似（圖5L）。這種作用呈劑量依賴性，表明TA和EGCG能夠隔離游離Fe并使其失活。鐵死亡觸發(fā)脂質(zhì)過氧化，增加ROS生成，導致細胞內(nèi)線粒體ROS水平升高和線粒體膜電位（MMP）下降，導致線粒體碎片化。研究者使用MitoSOX探針監(jiān)測細胞中線粒體ROS水平。RSL3處理使線粒體ROS水平增加到148%，與健康細胞相比。相反，TA和EGCG分別將RSL3處理的細胞中的ROS水平降低至95%和91%，表明它們有能力預防鐵死亡ROS介導的線粒體損傷（圖5M）。通過探針檢測MMP的變化，證實RSL3誘導的鐵死亡和PP處理的逆轉(zhuǎn)。RSL3處理細胞后，MMP下降至76%，與正常細胞比較差異有統(tǒng)計學意義。然而，TA和EGCG處理分別將MMP恢復至93%和95%，表明對功能性線粒體損傷有預防作用（圖5N）。采用Mito-TG.45染色法檢測TA和EGCG對鐵死亡細胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷的保護作用采用活細胞熒光顯微鏡觀察RSL3單獨處理或TA和EGCG聯(lián)合處理的細胞。值得注意的是，經(jīng)TA和EGCG處理的細胞保持了健康的管狀結(jié)構(gòu)，支持這些PPs對鐵死亡線粒體損傷的保護作用，ROS和MMP研究證明了這一點（圖5R，S）。

圖5 細胞研究表明TA和EGCG能夠從鐵死亡和Aβ中拯救神經(jīng)元細胞42-誘導毒性

6. 從淀粉樣蛋白誘導的鐵死亡中拯救神經(jīng)元細胞
       TA和EGCG調(diào)節(jié)Aβ₄₂聚集的有效性促使研究者研究它們拯救神經(jīng)細胞免受Aβ₄₂誘導的毒性的能力。分別用Aβ₄₂、TA和EGCG處理SH-SY5Y細胞。Aβ₄₂處理細胞30h后，細胞存活率為34.8%，與未處理的對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義。然而，在PPs存在的情況下，研究者觀察到Aβ42處理的神經(jīng)元細胞以劑量依賴性的方式得到挽救，最高濃度的TA和EGCG分別使細胞存活率提高到63%和69%（圖5T）。在AD的鐵死亡背景下，鐵加速毒性淀粉樣蛋白（Aβ₄₂-Fe）纖維的積累，產(chǎn)生活性氧，導致膜損傷和脂質(zhì)過氧化。研究者使用MTT法檢測TA和EGCG調(diào)節(jié)毒性Aβ₄₂ + Fe聚集和拯救神經(jīng)元細胞免于Aβ₄₂ + Fe誘導的鐵死亡的能力。Aβ₄₂: Fe（1: 5）處理組細胞存活率為17%，對照組細胞存活率為100%。然而，用TA和EGCG處理后，Aβ₄₂ + Fe處理的細胞存活率分別提高到74%和77%，呈劑量依賴性（圖5U，V）。將細胞分為Aβ₄₂ + Fe組和TA + EGCG組，DCFDA法檢測細胞內(nèi)ROS水平；Aβ₄₂ + Fe（1:5）培養(yǎng)6h后，細胞內(nèi)ROS由未處理組的31%增加至100%。然而，TA和EGCG處理后，Aβ₄₂ + Fe處理細胞中的ROS水平分別降低至36%和38%，表明它們具有復合體和使Fe氧化還原失去活性、調(diào)節(jié)Aβ₄₂ - Fe fenton型反應并最終阻止ROS生成的能力（圖50）。這些細胞研究有力地支持TA和EGCG能夠減輕RSL3誘導的鐵死亡和Aβ₄₂ - Fe相關(guān)毒性，使它們成為協(xié)同靶向鐵死亡和AD的潛在候選藥物。結(jié)合ThT研究，研究者評估了TA保護神經(jīng)元細胞免受tau誘導的毒性的能力。在AA誘導的tau聚集物存在下，與健康細胞相比，細胞活力降低至47%（圖5W）。TA可以劑量依賴性地增加細胞活力，將細胞活力提高到100%。
       為了證實Aβ₄₂與鐵死亡之間的關(guān)系，研究者采用免疫熒光法檢測Aβ₄₂ + Fe單獨孵育以及TA和EGCG共同孵育的SH-SY5Y神經(jīng)元細胞株中GPX4的水平。與健康細胞相比，Aβ₄₂ + Fe（1:5）處理細胞30小時顯著降低GPX4水平至65%（圖6）。據(jù)研究者所知，這是第一個在鐵死亡背景下的神經(jīng)細胞中Aβ₄₂ + Fe和GPX4水平直接相關(guān)的報告，通過直接定量蛋白水平的免疫熒光測定確定。與未處理的對照細胞相比，TA顯著增加了Aβ₄₂ + Fe處理的細胞GPX4水平（147%），表明TA可以在AD病理條件下提高GPX4水平。

圖6 通過免疫熒光（IF）測定進行蛋白質(zhì)定量

       這些發(fā)現(xiàn)促使研究者在神經(jīng)元細胞中檢測TA作為GPX4增強子的作用。研究者觀察到，與未處理的細胞相比，TA處理的細胞內(nèi)GPX4水平增加到192%（圖7A，B）。TA不僅增強GPX4活性，而且增加其在細胞中的水平。蛋白質(zhì)印跡檢測GPX4蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與未處理的細胞相比，TA處理使GPX4水平增加到127%（圖7C，D）?；谶@些發(fā)現(xiàn)，研究者檢測了抗氧化主要調(diào)節(jié)因子核因子e2相關(guān)因子2（Nrf2）的變化，已知Nrf2可直接和間接調(diào)節(jié)GPX4及其相關(guān)抗氧化蛋白46雖然有報道表明TA能夠激活Nrf2通路，但研究者評估了在神經(jīng)細胞中TA處理后Nrf2的激活。研究表明，TA處理導致SH-SY5Y細胞中Nrf2積累和核轉(zhuǎn)位。與未處理的細胞相比，細胞內(nèi)Nrf2水平增加到148%，并且使用TA處理后，來自細胞質(zhì)的Nrf2蛋白發(fā)生了2倍的核易位（圖7E-G）。因此，研究者推測TA可能通過Nrf2-GPX4軸提高GPX4水平。

圖7 通過IF測定和蛋白質(zhì)印跡進行蛋白質(zhì)定量

結(jié)論
       該研究發(fā)現(xiàn)天然的TA是一種高效的鐵死亡抑制劑。它通過鐵螯合、抑制脂質(zhì)過氧化、拯救線粒體損傷和激活Nrf2-GPX4軸等鐵死亡的所有主要途徑發(fā)揮作用，從而提高它們的水平。同時，TA是一種有效的Aβ₄₂和tau蛋白聚集的抑制劑，有效地調(diào)節(jié)劇毒鐵誘導的Aβ₄₂聚集，減少氧化應激，對抗AD患者的鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)。雖然GPX4蛋白的合成效率非常低且需要大量能量，但研究者證明了一種天然的多酚如何提供一種可行的解決方案，以協(xié)同調(diào)節(jié)鐵死亡和AD的多方面毒性，而GPX4的激活是關(guān)鍵機制之一。這可能鼓勵研究人員探索無毒的天然產(chǎn)物來解決問題，并強調(diào)GPX4在有效調(diào)節(jié)鐵死亡以及闡明其在AD中的作用的重要性。

實驗方法
ABTS抗氧化試驗，鐵抗壞血酸測定，硫黃素T(ThT)熒光檢測，細胞培養(yǎng)和MTT法檢測，ROS測定，神經(jīng)細胞拯救實驗，溫滴定量熱法(ITC)測量，蛋白質(zhì)印跡，免疫熒光
參考文獻
Baruah P, Moorthy H, Ramesh M, Padhi D, Govindaraju T. A natural polyphenol activates and enhances GPX4 to mitigate amyloid-β induced ferroptosis in Alzheimer's disease. Chem Sci. 2023 Aug 22;14(35):9427-9438. doi: 10.1039/d3sc02350h.