Treg細胞來源的外泌體miR-2861-脊髓損傷治療的新靶點

       血脊髓屏障(BSCB)是血液和脊髓實質(zhì)之間的物理屏障。目前的證據(jù)表明，脊髓損傷后BSCB完整性的破壞可導(dǎo)致繼發(fā)性損傷，如脊髓水腫和過度炎癥反應(yīng)。Treg細胞是有效的抗炎細胞，可抑制脊髓損傷后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，其在脊髓損傷后的浸潤表現(xiàn)出與BSCB自動修復(fù)相同的時空特征。然而，很少有研究評估Treg細胞與脊髓損傷之間的關(guān)系，強調(diào)BSCB的完整性。本研究探討Treg是否影響脊髓損傷后BSCB的恢復(fù)及其機制。我們證實脊髓損傷后同時發(fā)生血管生成和Treg細胞浸潤。此外，我們觀察到Treg細胞敲除和過表達對小鼠BSCB修復(fù)和運動功能的顯著影響。隨后，我們在體外證明了外泌體的存在和功能。此外，我們發(fā)現(xiàn)Treg細胞來源的外泌體包裹miR-2861，miR-2861調(diào)節(jié)血管緊密連接(TJs)蛋白的表達。熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-2861對IRAK1的負調(diào)控，一系列拯救實驗證實了IRAKI在調(diào)節(jié)BSCB中的生物學(xué)功能?？傊覀冏C明Treg細胞來源的外泌體可以包裝和遞送miR-2861并調(diào)節(jié)IRAK1的表達，從而影響小鼠脊髓損傷后BSCB的完整性和運動功能，這為脊髓損傷后的功能修復(fù)和限制炎癥提供了新的見解。本文于2023年10月發(fā)表于“Journal of Nanobiotechnology”（IF=10.2）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）脊髓損傷后血脊髓屏障完整性的破壞和損傷部位Treg細胞的浸潤
       在本研究中，我們利用CD31標(biāo)記來跟蹤健康脊髓組織和損傷部位，以監(jiān)測脊髓損傷后血管恢復(fù)和血脊髓屏障的任何破壞(圖1A)。我們發(fā)現(xiàn)，損傷部位的血管密度在第3天低于正常脊髓組織(1A, 1B)。第7天損傷部位與正常脊髓組織的血管密度無明顯差異(圖1A, 1B)。這些結(jié)果證實脊髓損傷后第3天損傷部位血管開始修復(fù)，并在第7天達到穩(wěn)定狀態(tài)。然后將FITC-葡聚糖注射到脊髓損傷小鼠和正常小鼠體內(nèi)，量化其熒光強度，觀察脊髓損傷后血脊髓屏障的狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，脊髓損傷組損傷部位的熒光強度明顯增加(圖1C, 1D)，這意味著BSCB受到嚴重損傷，導(dǎo)致SCI后FITC-葡聚糖滲透。對脊髓損傷后脊髓組織損傷區(qū)和非損傷區(qū)血管緊密連接相關(guān)蛋白進行免疫熒光染色，觀察血管緊密連接情況。我們的研究結(jié)果表明，與非損傷區(qū)域相比，ZO-1和Occludin與CD31在損傷區(qū)域的共定位顯著減少(圖1E-1H)。同時，western blotting顯示TJS相關(guān)蛋白的表達逐漸減少(圖1F)。這些結(jié)果證實了脊髓損傷后損傷區(qū)BSCB的完整性受到影響并逐漸加重。免疫熒光實驗顯示，脊髓損傷后損傷部位有顯著的Treg細胞浸潤(圖1H、1I)。據(jù)此，我們推測Treg細胞可能影響B(tài)SCB的修復(fù)。

2）Treg細胞促進脊髓損傷小鼠BSCB修復(fù)和運動功能恢復(fù)
       為了探討Treg細胞對BSCB修復(fù)的影響，我們首先建立了Foxp3^DTR轉(zhuǎn)基因小鼠，通過注射白喉毒素(DT)選擇性敲除Treg細胞并驗證敲除效率。將Treg細胞注射到Foxp3^DTR轉(zhuǎn)基因小鼠的尾靜脈后，建立Treg細胞過表達小鼠模型。Foxp3^DTR + DT組TJs蛋白與血管的共定位低于Foxp3^DTR + PBS和Foxp3^DTR + Treg組(圖2A、2B)，而Foxp3^DTR + Treg組TJs蛋白與血管的共定位明顯高于其他兩組(圖2A、2B)。這些結(jié)果表明敲除Treg細胞可以抑制SCI小鼠脊髓中TJs相關(guān)蛋白的表達。Treg細胞的過表達可以幫助TJs蛋白和血管更好地共定位，與Western blotting結(jié)果一致(圖2C)。為探討不同治療方法對脊髓損傷小鼠運動功能的影響，分別對三組脊髓損傷小鼠進行足跡分析。Foxp3^DTR + DT組的足跡分析結(jié)果最差，其次是Foxp3^DTR + PBS組，F(xiàn)oxp3^DTR + Treg組(圖2D, 2E)。游泳試驗和Basso小鼠量表(BMS)行為分析顯示相似的結(jié)果(圖2F-2H)。這些結(jié)果證實了Treg細胞對脊髓損傷小鼠運動功能的影響。根據(jù)上述結(jié)果，我們認為損傷部位Treg細胞的積累可以促進脊髓損傷后小鼠BSCB的恢復(fù)，改善運動功能。

3）Treg來源的外泌體促進bEND.3細胞中緊密連接蛋白的表達
       為了進一步探討Treg細胞對脊髓損傷小鼠BSCB的作用機制，我們采用氧-葡萄糖剝奪/再氧化(OGD/R)處理bEnd. 3細胞體外構(gòu)建BSCB損傷模型，并進行免疫熒光染色。實驗結(jié)果表明，與OGD/R 處理的bEnd. 3細胞相比，T-CM處理組Occludin和ZO-1蛋白的表達明顯增加(圖3A, 3B)。細胞分泌的外泌體已被證明在細胞通訊中起作用。為了進一步探討T-CM的作用，用外泌體抑制劑GW4869處理與T-CM共培養(yǎng)的bEnd. 3細胞。GW4869的加入逆轉(zhuǎn)了T-CM對TJs蛋白表達的刺激作用(圖3A,3 B)。western blotting驗證了上述結(jié)果(圖3C)。內(nèi)皮通透性和跨內(nèi)皮電阻(TEER)被用來評估外泌體的治療效果(圖3D, 3E)。上述證據(jù)證實了Treg細胞可以通過分泌外泌體影響bEND. 3細胞中TJs蛋白表達的猜想。我們通過透射電子顯微鏡(TEM)和納米顆粒跟蹤分析(NTA)(圖3F, 3G)鑒定了Treg細胞來源的外泌體，并通過western blotting(圖3H)驗證了它們。

4）Treg來源的外泌體促進脊髓損傷小鼠的BSCB修復(fù)和運動功能恢復(fù)
       為了探討Treg來源的外泌體(Treg-Exos)是否在SCI小鼠BSCB修復(fù)中發(fā)揮作用，我們將分離的外泌體注射到SCI小鼠體內(nèi)，然后對小鼠脊髓進行免疫熒光染色。與SCI + PBS組相比，SCI +外泌體組Occludin和ZO-1與CD31的共定位更為明顯。(圖4A, 4B)。這些結(jié)果表明，注射外泌體后，SCI小鼠的BSCB修復(fù)更為顯著，與FITC-葡聚糖滲透實驗和western blot的結(jié)果相似(圖4C-4E)。我們通過多項行為分析比較了SCI +外泌體組與SCI + PBS組的運動功能，發(fā)現(xiàn)外泌體治療后，前者的運動功能較后者有明顯改善(圖4F-4K)。

5）外泌體在體外遞送miR-2861作用于bEND.3細胞以改善TJs蛋白表達
       考慮到外泌體可以傳遞miRNA并發(fā)揮調(diào)控作用，我們從GEO數(shù)據(jù)庫中選擇了來自Treg細胞和源自Treg的外泌體的TOP20 miRNA，經(jīng)交叉后獲得5個miRNA，其中選擇了miR-2861進行進一步研究。在確定miR-2861在外泌體中的存在后，我們試圖確認外泌體中的miR-2861是否可以在BSCB恢復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)作用。因此，我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染敲低和過表達miR-2861，并分別構(gòu)建相應(yīng)的陰性對照(miR-2861^KD、miR-NC^KD、miR-2861^OE和miR-NC^OE)。通過qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率(圖5A)。為了觀察miR-2861在細胞水平上的作用，我們從慢病毒轉(zhuǎn)染的Treg細胞模型中提取外泌體(miR-NC^KD-Exos, miR-2861^KD-Exos, miR-NC^OE-Exos和miR-2861^OE-Exos)，并將外泌體與OGD/ R處理的bEnd. 3細胞共培養(yǎng)。我們發(fā)現(xiàn)miR-2861在miR-2861^KD-Exos組中的表達明顯低于miR-NC^KD-Exos組。此外，miR-2861在miR-2861^OE-Exos組中的表達明顯高于miR-NC^OE-Exos組(圖5B)。在bEnd. 3個細胞中，各組miR-2861的表達趨勢相同，這與外泌體組miR-2861的表達水平相對應(yīng)(圖5C)。免疫熒光染色顯示，miR-2861^KD-Exos組Occludin和ZO-1的熒光強度明顯低于miR-NC^KD-Exos組。在miR-2861^OE-Exos組中觀察到相反的結(jié)果(圖5D,5 E)，與WB(圖5F)一致。這些結(jié)果表明miR-2861的敲低和過表達可能會降低和增加TJs蛋白的表達。我們還觀察了bEND. 3細胞的滲透性和TEER。發(fā)現(xiàn)miR-2861^KD-Exos組通透性增加，miR-2861^OE-Exos組通透性降低(圖5G)。miR-2861^KD-Exos組TEER顯著降低，miR-2861^OE-Exos組TEER升高(圖5H)。以上結(jié)果有力地證明了miR-2861是一種促進BSCB修復(fù)的生物介質(zhì)，探索其潛在機制具有重要意義。

6）miR-2861在體內(nèi)修復(fù)BSCB并增加運動功能
       在驗證了miR-2861在細胞水平上的作用后，我們試圖闡明miR-2861在SCI小鼠體內(nèi)的功能。我們將外泌體分為miR2861^KD-Exos、miR-NC^KD-Exos、miR-2861^OE-Exos和miR-NC^OE-Exos，并將其注射到SCI小鼠體內(nèi)。我們發(fā)現(xiàn)miR-2861^KD-Exos組TJs蛋白和血管的共定位強度明顯低于miR-NC^KD-Exos組，而miR-2861^OE-Exos組TJs蛋白和血管的共定位強度高于miR-NC^OE-Exos組(圖6A, 6B)。這一發(fā)現(xiàn)得到了Western blot結(jié)果的支持(圖6C)。采用行為分析實驗觀察脊髓損傷小鼠運動功能的改善。MEP和BMS評分分析顯示，低表達miR-2861不利于運動功能的恢復(fù)，而高表達miR-2861可以增強運動功能(圖6D-6G)?？傊覀冏C實miR-2861可以通過外泌體運輸，調(diào)節(jié)BSCB的修復(fù)，從而改善運動功能。

7）miR-2861通過抑制IRAK1表達促進BSCB修復(fù)
       為了進一步探索miR-2861的具體機制，我們利用在線數(shù)據(jù)庫對miR-2861的潛在靶基因進行了分析和預(yù)測。其中，IRAK1與炎癥有關(guān)，其3 ' UTR可能被miR-2861識別并結(jié)合。為了驗證我們的猜想，基于IRAK1潛在結(jié)合位點構(gòu)建IRAK1野生型(WT)和突變型(MUT) 3 ' -UTR序列(圖7A)，并與miR-2861序列共轉(zhuǎn)染到bEnd. 3細胞。熒光素酶報告基因分析顯示，當(dāng)WT-IRAK1-3'UTR和miR-2861^OE組共轉(zhuǎn)染時，熒光素酶活性顯著低于WT-IRAK1-3'UTR和miR-NC^OE組。然而，當(dāng)MUT-IRAK1-3'UTR和miR-2861^OE共轉(zhuǎn)染時，熒光素酶活性與對照組沒有顯著差異(圖7B)，這表明IRAK1的3'UTR可以特異性結(jié)合miR-2861。我們進一步通過qRT-PCR和Western blot驗證了miR-2861可以負調(diào)控IRAK1(圖7C, 7D)。我們設(shè)計功能缺失和功能獲得實驗來進一步研究miR-2861與IRAK1之間的關(guān)系以及IRAK1對BSCB的影響。用miR-NC^OE-Exos和miR-2861^OE-Exos處理過表達IRAK1的bEnd. 3細胞，敲除IRAK1后，用miR-NC^KD-Exos和miR-2861^KD-Exos處理bEnd. 3細胞。結(jié)果表明，IRAK1過表達逆轉(zhuǎn)了miR-NC^OE-Exos和miR- 2861^OE-Exos誘導(dǎo)的TJs蛋白高表達(圖7E, 7F)。IRAK1過表達還逆轉(zhuǎn)了外泌體誘導(dǎo)的FITC-葡聚糖通透性降低和TEER升高(圖7G, 7H)。同樣，我們發(fā)現(xiàn)，敲低IRAK1可消除miR-NC^KD-Exos或miR-2861^KD-Exos對TJs的有害作用(圖7I,7 J)。FITC-葡聚糖通透性和TEER值產(chǎn)生相似的結(jié)果(圖7K, 7L)。以上數(shù)據(jù)提示miR-2681可以靶向IRAK1影響B(tài)SCB完整性。

結(jié)論
       本研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后損傷部位有Treg細胞浸潤。Treg細胞分泌的外泌體可促進BSCB的修復(fù)，降低其通透性，從而減輕浸潤引起的興奮損傷，促進運動功能的恢復(fù)?？傊?，我們的發(fā)現(xiàn)揭示了治療脊髓損傷的新靶點。

實驗方法
外泌體分離和鑒定，跨膜電阻測量，滲透率檢測，體內(nèi)滲透性測定，游泳測試，BMS行為學(xué)分析，電生理檢測，WB，qRT-PCR，免疫熒光，熒光素酶報告試驗。
參考文獻
Kong G, Xiong W, Li C, Xiao C, Wang S, Li W, Chen X, Wang J, Chen S, Zhang Y, Gu J, Fan J, Jin Z. Treg cells-derived exosomes promote blood-spinal cord barrier repair and motor function recovery after spinal cord injury by delivering miR-2861. J Nanobiotechnology. 2023 Oct 4;21(1):364. doi: 10.1186/s12951-023-02089-6.