單細(xì)胞測序揭示新的CAF細(xì)胞亞群在食管癌惡性進展中的作用
食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)生過程由正常上皮細(xì)胞向上皮內(nèi)瘤變，最后向浸潤性癌轉(zhuǎn)變。然而，癌前病變?nèi)绾芜M展為癌仍然是一個謎。本研究報告了一個全面的細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組研究79個多階段食管病變29例食管鱗癌患者。研究揭示了ANXA 1表達在上皮細(xì)胞中的逐漸和顯著的損失，是由于其轉(zhuǎn)錄因子KLF 4沿著病變進展。本研究于2023年5月發(fā)表于《Cancer Cell》上，IF=50.3 。
技術(shù)路線
主要研究內(nèi)容
1.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析解讀多階段食管鱗癌腫瘤發(fā)生中的不同細(xì)胞類型
對79個手術(shù)取出的食管樣品進行scRNA-seq，包括45個NOR、9個LGIN、9個HGIN和來自29名ESCC患者的16個腫瘤（圖1A）?；趫D的聚類和典型細(xì)胞標(biāo)記注釋揭示了七種主要的細(xì)胞類型，即，上皮細(xì)胞（n = 5，218）、成纖維細(xì)胞（n = 28，530）、內(nèi)皮細(xì)胞（n = 14，388）、T細(xì)胞（n = 63，332）、B細(xì)胞（n = 38，220）、骨髓細(xì)胞（n = 21，627）和肥大細(xì)胞（n = 5，177），這些細(xì)胞類型的組成在不同的疾病階段不同（圖1B）。發(fā)現(xiàn)>25%的NOR和LGIN階段的上皮細(xì)胞高度表達MD程序，而該細(xì)胞亞型的比例在HGIN和ESCC階段降低至<6%，表明MD程序在保持食管上皮細(xì)胞的正常表型中起重要作用（圖1C）。超過95%的NOR和LGIN階段的成纖維細(xì)胞被鑒定為NF。CAF出現(xiàn)在HGIN階段，占ESCC中總成纖維細(xì)胞的63%（圖1D）。以表達IGFBP 3（Endo-IGFBP 3）為特征的內(nèi)皮細(xì)胞亞型在ESCC中增加至50%，但僅分別占NOR、LGIN和HGIN階段的總內(nèi)皮細(xì)胞的近25%（圖1 E）。如預(yù)期的，在ESCC腫瘤發(fā)生期間的不同階段，五種免疫細(xì)胞類型B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的比例變化（圖1F）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然B細(xì)胞比例由NOR的27%下降到ESCC的16%，但LGIN和HGIN的B細(xì)胞比例增加，分別為43.2%和47.0%;雖然ESCC中CD 8 + T細(xì)胞比例（51.3%）明顯高于NOR（26.7%），但NOR、LGIN（26.1%）和HGIN（24.3%）的比例相似。這些結(jié)果提示，食管鱗癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞數(shù)量的變化可能是食管鱗癌發(fā)生的晚期事件。
圖1：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析解讀多階段食管鱗癌腫瘤發(fā)生中的不同細(xì)胞類型
2.食管鱗癌發(fā)生過程中ANXA1在上皮細(xì)胞中的表達逐漸受到抑制
進一步探索了不同疾病階段上皮細(xì)胞的組成和轉(zhuǎn)錄改變。分析的上皮細(xì)胞（n = 5，218）由來自NOR的1，002個細(xì)胞、來自LGIN的205個細(xì)胞、來自HGIN的1，097個細(xì)胞和來自ESCC的2，914個細(xì)胞組成（圖2A）。無監(jiān)督聚類分析揭示了在ESCC發(fā)展期間以不同表達程序為特征的八種不同上皮細(xì)胞類型（圖1C、2A和S2 A;表S2）。具有四種表達程序的上皮細(xì)胞，即，QP、CY、MD和TD占正常上皮細(xì)胞的88.1%（883/1，002）;然而，在ESCC腫瘤中表達這些程序的細(xì)胞的百分比下降到43.1%（2，914個中的1，256個）（圖2A）。相比之下，在ESCC發(fā)展過程中，表達其他四種癌癥相關(guān)程序（包括HY、RS、DO和AP）的上皮細(xì)胞的比例從9.8%增加到56.9%（圖2A和2B）。計算了程序標(biāo)記基因的平均表達的Z評分，并且結(jié)果還顯示與NOR相比，HGIN（p = 1.45×10-58）和ESCC（p = 1.94 ×10-105）中MD程序的顯著降低（圖2B）。選擇了ANXA 1進行驗證和深入分析，發(fā)現(xiàn)ANXA 1表達水平從NOR逐漸降低到LGIN、HGIN和ESCC（圖2C，趨勢檢驗，p = 4.45×10-80），這通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析證實，顯示位于上皮中的ANXA 1 RNA水平與NOR（分別為p = 3.80×10-161和p<10-308）或LGIN（分別為p=2.14×10-114和p=4.84×10-187）相比顯著降低，趨勢檢驗P為6.57 ×10-17（圖2D和2 E）。還對不同疾病分期的組織進行了ANXA 1免疫組化染色，結(jié)果進一步證實，與NOR組織相比，ANXA 1在癌前和ESCC部位的蛋白水平顯著下調(diào)（p=7.41×10-3，p=9.69×10-4和p = 3.52×10-6;趨勢檢驗，p= 7.36×10-15;圖2F）。這些結(jié)果有力地表明，食管特異性蛋白ANXA 1的功能喪失可能是ESCC腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵事件。
圖2：食管鱗癌發(fā)生過程中上皮細(xì)胞ANXA1表達的逐漸抑制
3.上皮細(xì)胞中ANXA1抑制促進NFs向CAFs的轉(zhuǎn)化
鑒定了表達SLPI（NF-SLPI）、CCN 2（NF-CCN 2）或APOE（NF-APOE）標(biāo)志物基因的三種NF，以及兩種CAF類型，即：基于已知的CAF標(biāo)志物基因，可以鑒定炎性CAF（iCAF）和成肌纖維細(xì)胞CAF（myCAF）（圖3A）。iCAF顯示活性趨化因子產(chǎn)生途徑，具有高表達水平的諸如IL 24和CXCL 18的基因，而myCAF具有高表達水平的與ECM重塑和降解相關(guān)的基因，諸如MMPl和MMPll（圖3B和3C）。然后，構(gòu)建了成纖維細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的軌跡，結(jié)果顯示CAF活化軌跡從NF-SLPI亞型開始，通過NF-CCN 2到iCAF和最終的myCAF，而NF-APOE通過次要軌跡被活化為NF子集（圖3D）。沿著該軌跡，一致地鑒定了在NF中活化的途徑在起始點富集，而膠原蛋白三聚體中的CAF相關(guān)基因（即，CAF相關(guān)基因）在起始點富集。COL 1A 1和CTHRC 1）、炎癥（即，CXCL 1、CXCL 8和IL 24）和ECM重塑（即，F(xiàn)AP、MMPl和MMPll）在成纖維細(xì)胞活化的晚期富集（圖3E）。提示在食管鱗癌的形成和發(fā)展過程中，早在HGIN甚至LGIN階段，微環(huán)境中的NF就被激活為CAFs。計算成纖維細(xì)胞標(biāo)志物基因在NFS和CAF中的表達分?jǐn)?shù)以量化其生物學(xué)功能，并與上皮細(xì)胞表達程序分?jǐn)?shù)進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，在8種上皮細(xì)胞方案中，只有MD方案的評分與NF簽名評分顯著正相關(guān)(r=0.29，p=0.014)，而與ICAF(r=-0.24，p=0.041)和myCAF0.27(r=-0.27，p=0.022)簽名評分顯著負(fù)相關(guān)(圖3F）?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果進一步驗證了ANXA 1與NF活性呈負(fù)相關(guān)，與CAF活性呈負(fù)相關(guān)。具體地，揭示了隨著上皮中ANXA 1 RNA水平從LGIN/HGIN到ESCC降低，固有層和粘膜下層中的NF特征評分也顯著降低；然而，當(dāng)ANXA 1表達在ESCC發(fā)展期間被抑制時，iCAF和myCAF特征評分顯著增加（圖3 H和3 I）。這些結(jié)果表明，食管上皮細(xì)胞分泌的ANXA 1可能通過上皮細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的相互作用在調(diào)控微環(huán)境NF中發(fā)揮重要作用，上皮細(xì)胞ANXA 1功能的缺失可能導(dǎo)致NF向CAF轉(zhuǎn)化。
圖3：上皮細(xì)胞中的ANXA 1抑制促進NF轉(zhuǎn)化為CAFs
4.上皮ANXA1抑制促進myCAF在體外和體內(nèi)的活化
分別從5例ESCC患者的NOR、LGIN、HGIN和ESCC組織中獲得食管類器官和成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的免疫熒光染色和類器官及其相應(yīng)組織的組織病理學(xué)表征以及選擇標(biāo)志物的免疫化學(xué)染色的圖像示于圖4A。食管組織的免疫熒光分析還顯示，上皮細(xì)胞和ECM中的ANXA 1水平被抑制，同時HGIN和ESCC組織中周圍基質(zhì)中的FAP（CAF活化標(biāo)志物）水平顯著增加（圖4 B），進一步證實了兩種細(xì)胞類型之間的相關(guān)性和潛在的相互作用。然后建立了ANXA 1缺失或過表達的ESCC和正常食管上皮細(xì)胞系（OE；圖4C），并將它們與NF共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞共培養(yǎng)的那些相比，NF在與ANXA 1耗盡的ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)時具有顯著更高的迀移能力，但在與ANXA 1-OE ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)時具有顯著更低的迀移能力（圖4D）。與相應(yīng)的對照相比，myCAF活化標(biāo)志物在與ANXA 1敲除（KO）細(xì)胞共培養(yǎng)的NF中顯示一致的上調(diào)，但在與ANXA 1-OE細(xì)胞共培養(yǎng)的NF中顯示一致的下調(diào)。然而，在這些體外實驗環(huán)境中，未檢測到iCAF相關(guān)標(biāo)志物變化（圖4 E）。此外，將重組人ANXA 1蛋白（rANXA 1）添加到NF和ESCC的共培養(yǎng)物中以劑量依賴性方式基本上抑制myCAF活化，并且該效果與與具有強制ANXA 1過表達的ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)的效果相同（圖4F）。接下來檢測ECSS細(xì)胞中ANXA1表達的變化是否會影響與或不與從食管組織樣本中分離的NF共移植的小鼠腫瘤異種移植物的生長速率。如圖4G所示，與僅來源于ESCC細(xì)胞的異種移植物相比，來源于KYSE30細(xì)胞加NF的異種移植物具有顯著增加的生長速率，表明CAF可以促進ESCC進展。
圖4：上皮ANXA1抑制促進myCAF在體內(nèi)外的活化
5.ANXA1缺失通過減弱其與FPR2的相互作用促進myCAF活化
通過使用相互免疫共沉淀分析來檢查結(jié)合是否是通過FPR，如果是，則哪個FPR家族成員是ANXA1靶標(biāo)，結(jié)果顯示ANXA1特異性結(jié)合FPR2，而不是其他兩個FPR成員（圖5A和B）。這種配體-受體相互作用進一步得到免疫熒光測定的支持，所述免疫熒光測定顯示rANXAl和FPR 2在NF和CAF細(xì)胞膜中的共定位（圖5C）。還觀察了ANXA 1-FPR2結(jié)合破壞后NF向myCAF轉(zhuǎn)化的功能改變，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)FPR 2敲低NF與ANXA 1-OE ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)時，myCAF活化標(biāo)志物的表達水平顯著增加（圖5D），表明ANXA 1通過NF中與FPR 2的配體-受體相互作用對NF向myCAF轉(zhuǎn)化的控制作用。進一步檢查了抑制NF向myCAF轉(zhuǎn)化的ANXA 1FRP 2信號傳導(dǎo)的下游效應(yīng)子，并且發(fā)現(xiàn)ANXA 1-FPR 2相互作用強烈抑制AKT、ERK和SMAD 3的磷酸化，這伴隨著myCAF標(biāo)志物FAP、Vim、MMP 1和a-SMA的水平顯著降低（圖5E）。當(dāng)用rANXAl或ERK（SCH 772984）、AKT（MK-2206）和SMAD 3（SIS 3）的抑制劑處理NF時，也觀察到這些類似的變化（圖5 F）。盡管ANXAl和TGF-b作用的下游分子模塊可能相似，但TGF-b對NF轉(zhuǎn)化為myCAF的作用不依賴于FPR 2（圖5E）。這些結(jié)果表明正?；虬┬陨掀ぜ?xì)胞與NF或CAF之間的實質(zhì)性相互作用。最后，檢查了ANXA 1在由致癌物4-NQO誘導(dǎo)的小鼠ESCC模型中抑制ESCC發(fā)展和進展的潛在功能。我們向小鼠施用Ac2 -26（一種結(jié)合FPR受體的ANXA 1模擬肽）持續(xù)5周，并發(fā)現(xiàn)與用媒介物處理的對照小鼠相比，Ac 2 -26處理組中癌前病變和腫瘤的負(fù)擔(dān)顯著降低（圖5G）。這些體內(nèi)結(jié)果進一步支持ANXA 1在抑制ESCC中的重要作用。
圖5：ANXA1缺失通過減弱其與FPR2的相互作用促進myCAF活化
6.ANXA1功能的喪失是由其轉(zhuǎn)錄因子KLF4的抑制引起的
使用四個公共數(shù)據(jù)庫進行了計算機模擬分析，得到了ANXA 1的11個候選TF。然后，分析了scRNA-seq數(shù)據(jù)中這些TF的表達水平與ANXA 1之間的相關(guān)性，結(jié)果表明四種潛在的TF，KLF 4、KLF 5、CEBPB和FOXA 1，與ANXA 1 RNA水平顯著正相關(guān)（r > 0.3，p < 0.05；圖6A）。通過scRNA-seq和免疫化學(xué)染色，我們發(fā)現(xiàn)與NOR相比，從LGIN、HGIN到ESCC，KLF4 RNA和蛋白質(zhì)水平均顯著 降低（圖6 B和6C）。ANXA 1 RNA和KLF 4 RNA水平之間存在顯著正相關(guān)（r = 0.39，p = 5.4×10-5；圖6D）。HET-1A和KYSE 450細(xì)胞中的基因敲低測定顯示，在四種TF中，僅靶向KFL 4的小干擾RNA（siRNA）顯著抑制ANXA 1表達（圖6 E）。電泳遷移率變動測定證實KLF 4特異性結(jié)合ANXA 1啟動子序列，其可被抗KLF4的抗體消除（圖6 F）。染色質(zhì)免疫沉淀與定量聚合酶鏈反應(yīng)測定偶聯(lián)顯示ANXA 1被KLF4抗體顯著富集，并且結(jié)果在HET-1A、KYSE 450和KYSE 30細(xì)胞中是一致的（圖6 G）?？傊?，這些生化結(jié)果證明KLF 4是一種真正的TF，它能正向調(diào)節(jié)食管上皮細(xì)胞中ANXA 1的表達。最終證明了KLF 4調(diào)節(jié)ANXA 1轉(zhuǎn)錄，這連接到NFs向CAFs的轉(zhuǎn)化。為此，進行了體外實驗，以探討KLF 4表達狀態(tài)對CAF遷移和激活的影響。結(jié)果顯示，沉默KLF 4顯著增強CAF活化和迀移，而恢復(fù)ANXA 1（通過向共培養(yǎng)基中添加rANXA 1）可以顯著抑制由KLF 4抑制引起的CAF活化和迀移（圖6 H和6I）。這些結(jié)果支持KLF4調(diào)控ANXA1的轉(zhuǎn)錄，ANXA1調(diào)控NF向myCAF的轉(zhuǎn)化。我們還在正常食管樣品中進行了KLF4和ANXA1蛋白的免疫熒光染色，結(jié)果顯示這兩種分子共定位且正相關(guān)（圖6J）。
圖6：ANXA1缺失是由其轉(zhuǎn)錄因子KLF4的抑制引起的
結(jié)論
總之，本研究通過利用來自同一個ESCC個體的NOR、LGIN、HGIN和癌標(biāo)本，并使用整合的scRNA-seq、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、功能測定和動物實驗，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了ESCC從其癌前病變通過上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的異常串?dāng)_的進展的重要機制。本研究結(jié)果可能對了解癌癥的發(fā)展和ESCC的預(yù)防和臨床治療具有深遠的意義。
實驗方法
收集臨床樣本，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，軌跡分析，基因集變異分析，空間轉(zhuǎn)錄組測序， ANXA 1表達改變的細(xì)胞系的建立，基因表達的RNA干擾， Co-培養(yǎng)實驗，成纖維細(xì)胞遷移測定，小鼠異種移植實驗，小鼠原代ESCC模型和Ac 2 -26治療，定量實時PCR分析，蛋白質(zhì)印跡測定，免疫組織化學(xué)和多重免疫熒光分析，免疫熒光分析，免疫沉淀測定，酶聯(lián)免疫吸附測定，電泳遷移率轉(zhuǎn)移試驗，報告質(zhì)粒構(gòu)建和報告試驗，染色質(zhì)免疫沉淀偶聯(lián)定量PCR分析。
參考文獻
Chen, Y., Zhu, S., Liu, T., Zhang, S., Lu, J., Fan, W., Lin, L., Xiang, T., Yang, J., Zhao, X., Xi, Y., Ma, Y., Cheng, G., Lin, D., & Wu, C. (2023). Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer cell, 41(5), 903–918.e8. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.03.001