組織因子是放射治療誘導的膠質(zhì)母細胞瘤重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

       膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是最致命的腦癌，尚無有效的治療方法。目前，手術(shù)切除后放射治療（RT）和替莫唑胺化療是新診斷的GBM患者的標準療法。RT對GBM具有細胞抑制和細胞毒性的抗腫瘤作用，但腫瘤復發(fā)幾乎不可避免。在放療后，GBM腫瘤通過表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組景觀的全局重塑經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)變。RT增強腫瘤細胞分泌各種趨化因子、細胞因子和細胞外基質(zhì)分子。已知許多RT誘導的化學/細胞因子可誘導GBM細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變并介導GBM細胞與免疫細胞之間的相互串擾。此外，RT是凝血功能障礙和免疫調(diào)節(jié)的有效誘導劑。雖然上述RT誘導的全局變化長期以來一直被假設(shè)為腫瘤進化和復發(fā)腫瘤的侵襲性，但這些過程的上游啟動者知之甚少。在許多惡性腫瘤如GBM中，照射和靶向抑制劑可瞬間誘導腫瘤細胞衰老，稱為治療誘導衰老（TIS）。由于衰老程序涉及全局表觀基因組重編程和多種蛋白質(zhì)分泌的升高，稱為衰老相關(guān)分泌表型（SASP），TIS可能在RT誘導的全局變化中發(fā)揮作用。腫瘤細胞衰老的定義仍然不明確，關(guān)鍵問題尚未解決，包括衰老的腫瘤細胞狀態(tài)是如何調(diào)節(jié)的，以及TIS如何影響治療耐藥性和腫瘤復發(fā)。該研究發(fā)表在《Cancer Cell》，IF：38.585。
技術(shù)路線

機制圖

主要研究結(jié)果
1. 照射誘導的SA-βGal+ GBM細胞具有干性和衰老樣特征
       為了確定GBM腫瘤的衰老程度，研究者使用了三種不同的原位患者來源的GBM模型（圖1A）。照射荷瘤小鼠的大腦，用比色底物X-Gal或細胞透性熒光底物C12FDG20測量SA-βGal的活性（圖1A）。照射誘導了強烈的SA-βGal活性，特別是在腫瘤區(qū)域（圖1A）。為了確定SA-βGal+細胞的細胞類型，研究者植入紅色熒光蛋白（RFP）轉(zhuǎn)導的GBM腫瘤，在體內(nèi)照射小鼠，并用C12FDG染色（圖1B）。流式細胞術(shù)分析顯示，照射腦中超過90%的SA-βGal+細胞RFP陽性，表明主要是GBM細胞獲得了RT誘導的SA-βGal活性（圖1B）。
       為了研究照射后SA-βgal + GBM細胞的細胞狀態(tài)，研究者通過C12FDG染色和隨后的熒光激活細胞分選（FACS）分離SA-βgal +和SA-βgal-GBM亞群。DNA損傷修復活性和克隆生長能力是GBM放射抗性和隨后復發(fā)的關(guān)鍵照射后的C12FDG+細胞（RT-C12FDG+）顯示，與匹配的C12FDGlow/-或模擬分選的散裝腫瘤細胞相比，失調(diào)性毛細血管擴張突變和DNA檢查點激酶的活性增強（圖1C）。此外，RT-C12FDG+細胞表達巢蛋白，并且通過體外集落形成分析發(fā)現(xiàn)，克隆生成細胞高度富集（圖1D，E）。接下來，研究者確定了有或沒有照射的GBM腫瘤中代表性衰老標志物的水平。RT-C12FDG+細胞具有高水平的HP1γ和H3K9me3，但很少或不表達CDKN2A（圖1F-I）。值得注意的是，RT增加了同時表達nestin和H3K9me3的GBM細胞的數(shù)量，并在RT-C12FDG +細胞中進一步富集（圖1G）。
       為了檢測SA-βGal+ GBM細胞的全局轉(zhuǎn)錄組，研究者進行了scRNA-seq和大量RNA測序分析。研究者分析了大約100,000個單個GBM細胞，并根據(jù)干細胞的表達水平和細胞周期進展對這些細胞進行了分類。未處理和照射的GBM細胞都含有高表達細胞周期和/或干性基因特征的細胞群，反映了它們的侵襲性。值得注意的是，RT-C12FDG+亞群擁有大多數(shù)在干性基因特征上得分最高的單細胞（圖1H，I）。
       為了正式測試RT-SA-βGal+ GBM細胞是否可以克隆擴增并促進RT后腫瘤生長，研究者使用慢病毒介導的條形碼/RFP轉(zhuǎn)導技術(shù)對GBM細胞進行標記。研究者從照射標記的GBM腫瘤中分離出C12FDG+細胞，并立即將這些細胞注射到新受體小鼠的大腦中（圖1J-M）。RT- C12FDG+ GBM細胞在新受體小鼠中產(chǎn)生的腫瘤明顯大于未照射或照射的大塊腫瘤細胞（圖1K）。通過條形碼測序進行克隆擴增分析顯示，與未處理或散裝細胞相比，RT-C12FDG+ GBM細胞衍生的腫瘤中檢測到更多的單個條形碼（圖1L）。這一趨勢很好地證實了目前癌癥治療后克隆多樣性的概念。最后，研究者使用上述細胞群進行了體內(nèi)限制稀釋腫瘤形成試驗。來自兩種不同患者GBM的RT-C12FDG+細胞比RT-bulk或C12FDG?細胞含有更高的腫瘤形成細胞頻率（圖1M）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，照射誘導的SA-βGal+ GBM細胞具有干性和一些衰老樣特征，并且它們是促進放射治療后腫瘤生長的細胞群。

圖1 輻射誘導的SA-βGal+ GBM細胞在體內(nèi)克隆擴增

2. F3在照射后的C12FDG+ GBM細胞中高表達，與干細胞、細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變和分泌表型增強有關(guān)
       為了研究SA-βGal+ GBM細胞的細胞狀態(tài)和分子調(diào)節(jié)因子，研究者分析了細胞表面蛋白的水平。用C12FDG染色匹配的初始和照射的GBM細胞，分成單獨的孔，并與242個人類分化（CD）抗體簇中的每一個共染色（圖2A）。流式細胞術(shù)定量共染色結(jié)果，計算各CD標記物的表達水平。RT-C12FDG+細胞中富集的細胞表面受體包括ABCG2、JAMA、PDGFR、CD109和整合素蛋白，與干細胞性、GBM間質(zhì)轉(zhuǎn)化和治療耐藥性有關(guān)（圖2B）。在研究者的篩選中，最富集的CD標記物是CD142，最初被認為是一種啟動血液凝固的細胞表面受體與匹配的初始細胞相比，照射細胞中的組織因子/F3水平增加了10倍以上，RT-C12FDG+細胞中的組織因子/F3水平進一步增加（圖2B）。在受照射的患者來源的異種移植瘤(PDX)荷瘤小鼠中，研究者發(fā)現(xiàn)F3具有強大的誘導作用，與C12FDG+腫瘤細胞共定位（圖2C）。
       為了檢驗照射后的F3high細胞是否富集體內(nèi)致瘤能力，研究者在體內(nèi)照射5天后，通過F3抗體細胞分選從PDX腫瘤中分離出匹配的F3high和F3low/-細胞，然后將這些細胞注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)。與匹配的F3low/-或模擬分選的散裝腫瘤細胞相比，照射后的F3high亞群的腫瘤形成能力明顯更高（圖2D，E）。
       為了深入了解與F3相關(guān)的信號節(jié)點，研究者進行了ATAC-seq分析，以繪制匹配F3high和F3low/-亞群中具有開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基因組區(qū)域。RT-F3+ GBM細胞中最富集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序是STAT3、FOSL2、RELA以及Foxo4和TEAD2，其中大多數(shù)也在RT-C12FDG+ GBM細胞中富集（圖2F）。RT后，GBM腫瘤向MES亞型表型轉(zhuǎn)變，這是由NF-κB和STAT3信號激活介導的。然后，研究者通過免疫印跡、免疫染色和轉(zhuǎn)錄組分析來確定這些通路的激活狀態(tài)（圖2G-L）。與ATAC數(shù)據(jù)一致，照射的F3high GBM細胞活性NF-κB和STAT3以及干細胞相關(guān)蛋白的水平升高（圖2G，H）。通過使用抗F3抗體和240個人類CD標記進行額外的表面標記篩選，進一步支持了該亞群中活躍的整合素信號傳導。此外，RT-F3+細胞具有高水平的GBM間質(zhì)標志物（圖2J，K）。最后，分泌組分析和基因標記分析顯示，與大量未處理或照射的腫瘤細胞相比，照射的F3high的GBM細胞分泌的SASP因子如IL6、IL8、肝細胞生長因子和表皮生長因子水平明顯更高（圖2L，M）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，RT-F3+群體具有豐富的干性、間充質(zhì)GBM細胞轉(zhuǎn)化、衰老樣表觀基因組重編程和SASP特征。

圖2 F3在照射后的C12FDG+ GBM細胞中高度表達，與干性、細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變和分泌表型增強有關(guān)

3. F3信號在膠質(zhì)母細胞瘤和TME中引發(fā)輻射誘導的變化
       為了探討F3在體內(nèi)GBM輻射反應中的作用，研究者使用人PDX、GBM切片和同源小鼠膠質(zhì)瘤模型進行了免疫組織化學染色分析（圖3）。原位PDX荷瘤小鼠接受輻射，5天后采集腦組織。在F3強烈上調(diào)的區(qū)域，研究者發(fā)現(xiàn)F3與高水平的纖維蛋白正相關(guān)，纖維蛋白是F3啟動的凝血級聯(lián)的關(guān)鍵效應物（圖3A）。F3陽性的GBM細胞YKL-40、CD44 和FN1也呈陽性。已知纖維蛋白聚合物和FN1一起形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，稱為致癌臨時ECM。它為巨噬細胞、活化血小板、中性粒細胞胞外陷阱和各種生長因子和趨化因子的募集提供了一個支架事實上，研究者發(fā)現(xiàn)在放療腫瘤中F3陽性、纖維蛋白/FN1復合物富集區(qū)域的TAM和M2樣TAM數(shù)量顯著增加（圖3B，C）。
       為了在完整的免疫微環(huán)境中驗證上述發(fā)現(xiàn)，研究者采用了PDGFβ驅(qū)動的、p53缺失的同基因小鼠膠質(zhì)瘤，這是一種具有代表性的前膜亞型腫瘤初始腫瘤顯示相對較低的纖維蛋白、TAM和CD44+細胞的基礎(chǔ)水平。然而，照射后，研究者發(fā)現(xiàn)纖維蛋白聚合和TAM浸潤以及F3和CD44水平大量增加（圖3D-F）。值得注意的是，大多數(shù)CD163+、CD206+M2樣TAM在纖維蛋白聚合物富集、F3+、CD44+腫瘤區(qū)域檢測到，表明它們之間存在很強的正相關(guān)性（圖3G）。總之，這些數(shù)據(jù)進一步表明，RT誘導的凝血、致癌TAM和GBM間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間存在聯(lián)系。

圖3 輻射誘導腫瘤和微環(huán)境中F3 prime的全局變化

4. F3信號在GBM重編程和無線電抗性中的分子機制
       鑒于F3與RT誘導的GBM重塑之間存在強烈的時空關(guān)聯(lián)（圖3），研究者首先通過shRNA介導的F3敲低（KD）確定了F3在體內(nèi)的作用。將非靶向shRNA或表達F3 KD shRNA的GBM細胞移植到裸鼠腦內(nèi)，20天后開始體內(nèi)輻射（圖4A，B）。荷瘤腦切片的免疫染色分析顯示，F(xiàn)3抑制顯著消除了RT誘導的纖維蛋白聚合物和IBA1+和CD44+細胞的積累（圖4A）。與對照組相比，F(xiàn)3 KD或單獨照射可延長荷瘤小鼠的存活時間。值得注意的是，注射F3 KD細胞并給予輻射的組比其他所有組的存活時間要長得多（圖4B）。
       然后，研究者確定了F3 KD對NF-κB、STAT3和整合素信號激活狀態(tài)的影響（圖4）。在初始狀態(tài)下，F(xiàn)3 KD并沒有引起pp65和pSTAT3的顯著降低，這可能反映了F3的低水平。相反，F(xiàn)3 KD能有效抑制RT誘導的NF-κB、STAT3和整合素活性上調(diào)，以及間質(zhì)性狀的上調(diào)（圖4C，D）。相反，NF-κB或STAT3信號組構(gòu)活性突變體的過表達挽救了RT-F3 KD細胞的細胞存活，這表明NF-κB和STAT3活性都是RT誘導的F3信號傳導的關(guān)鍵下游效應物（圖4E）。
       研究者測定了照射或不照射下F3 KD GBM細胞分泌的細胞因子/趨化因子水平。F3 KD顯著降低了RT誘導的多種細胞因子/趨化因子的上調(diào)（圖4F）。為了研究F3在趨化因子介導的TAM募集中的作用，研究者使用U937巨噬細胞樣細胞進行了體外transwell實驗與來自匹配的初始細胞的條件培養(yǎng)基相比，來自照射GBM細胞的條件培養(yǎng)基吸引的U937細胞數(shù)量顯著增加。F3 KD使巨噬細胞募集水平降低約80%（圖4G）。在受輻射的F3 KD細胞中，NF-κB活性被強制激活而STAT3活性未被激活，可恢復SASP因子的分泌，p65 shRNA抑制NF-κB可顯著抑制RT誘導的SASP因子分泌，提示RT誘導的GBM中SASP在很大程度上依賴于NF-κB信號傳導（圖4H，I）。最后，在強力霉素介導的誘導F3 KD系統(tǒng)中，F(xiàn)3在腫瘤和體內(nèi)TME中的作用得到了進一步證實（圖4J）。這些數(shù)據(jù)支持F3是照射GBM細胞存活和細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變以及SASP因子分泌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

圖4 F3基因敲低抑制輻射誘導凝血、SASP因子分泌和TAM激活

5. 重組ΔFVII蛋白在體內(nèi)抑制輻射誘導的凝血、SASP因子分泌和TAM積累
       由于F3蛋白在與其配體F7結(jié)合后，最終通過泛素途徑被降解，研究者假設(shè)特定的F7衍生物可能直接觸發(fā)F3降解，而不會引發(fā)F3介導的致癌作用為了進行測試，研究者通過慢病毒轉(zhuǎn)導在GBM細胞中過表達一系列F7缺失突變體，并測定照射后這些GBM細胞的增殖情況（圖5A）。通過篩選，研究者發(fā)現(xiàn)了一個缺失突變體，可以有效地阻礙照射GBM細胞的生長，研究者將其命名為ΔFVII。
       ΔFVII強烈誘導泛素介導的F3蛋白降解，并顯著降低照射GBM細胞中F3蛋白的水平（圖5B，C）。與此一致的是，用ΔFVII處理一天的GBM細胞顯示磷酸化p65和STAT3蛋白顯著降低（圖5D）。此外，研究者發(fā)現(xiàn)ΔFVII降低了共免疫沉淀的F3 -整合素復合物、HUTS4和磷酸化的FAK的水平（圖5E）。然后研究者確定ΔFVII對GBM細胞存活和克隆生長的影響（圖5F，G）。ΔFVII處理有效地損害了輻射GBM細胞的存活，IC50在0.1-1 nM范圍內(nèi)（圖5F）。相比之下，正常神經(jīng)祖細胞和原代星形膠質(zhì)細胞即使在微摩爾ΔFVII濃度下也沒有表現(xiàn)出細胞毒性（圖5F）。實時細胞成像分析表明，ΔFVII處理可顯著損害照射后F3high GBM細胞的克隆生長（圖5G）。最后，為了確定ΔFVII對SASP因子分泌的影響，研究者用ΔFVII處理照射過的GBM細胞1天，并收集條件培養(yǎng)基。ΔFVII治療顯著降低了細胞因子的分泌（圖5H）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明ΔFVII是一種有效的抗GBM藥物，可減輕f3介導的致癌信號，特別是與RT聯(lián)合使用時。
       為了確定ΔFVII在體內(nèi)的作用，研究者從皮下腫瘤模型開始。當腫瘤達到~ 500 mm3時，研究者局部照射人PDX腫瘤，并通過靜脈注射ΔFVII蛋白（50μg/kg）。與初始對照組相比，放療后5天收獲的腫瘤顯示纖維蛋白/FN1復合物、腫瘤浸潤性CD11b+、F4/80+、CCR2+免疫細胞和CD163+ M2樣TAM顯著增加，F(xiàn)3大量上調(diào)（圖5I）。值得注意的是，ΔFVII處理有效地抑制了上述所有變化，C-Cas3+細胞的數(shù)量急劇增加（圖5I）。為了評估ΔFVII對信號通路激活和衰老樣特征的體內(nèi)影響，研究者從每組中收集腫瘤并對其進行處理以進一步分析。ΔFVII治療顯著降低了RT誘導的細胞存活信號，如STAT3，但增加了腫瘤中細胞死亡相關(guān)蛋白的水平（圖5J）。為了分析放射、ΔFVII或兩者治療的腫瘤內(nèi)的趨化因子/細胞因子微環(huán)境，研究者使用腫瘤裂解物進行了細胞因子分析。照射誘導分泌蛋白顯著上調(diào)，其中許多蛋白在巨噬細胞募集、M2樣TAM極化和細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變中具有眾所周知的功能。值得注意的是，ΔFVII治療顯著且全面地抑制了趨化因子/細胞因子水平（圖5K）。
       為了確定腫瘤和ΔFVII對全身止血的影響，研究者通過標準尾出血試驗測量了血液凝固活性（圖5M）。與對照小鼠相比，荷瘤小鼠的凝血時間較短，照射后凝血時間進一步縮短。雖然ΔFVII治療對非荷瘤小鼠的凝血時間沒有影響，但照射和ΔFVII聯(lián)合治療使RT荷瘤小鼠的高凝狀態(tài)恢復到接近正常范圍（圖5M）。腫瘤生長動力學研究表明，單獨照射或ΔFVII單藥治療可將腫瘤的生長速度抑制至未發(fā)腫瘤的50-60%左右，但單獨使用這兩種藥物的作用都是短暫的，并導致腫瘤快速再生（圖5L，N）。相比之下，聯(lián)合治療使腫瘤幾乎完全消退（圖5N）。

圖5 ΔFVII治療抑制了RT誘導的體內(nèi)凝血、SASP因子分泌和TAM積累

6. ΔFVII治療對原位PDX模型GBM腫瘤放射敏感
       研究者使用患者來源的022或827 GBM細胞測試了ΔFVII重組蛋白在原位GBM PDX模型中的作用。腫瘤細胞植入后20天或25天開始照射，并在照射的同時靜脈注射ΔFVII蛋白（圖6A）。照射5天后，采集各組腦組織進行免疫染色和腫瘤解剖免疫印跡分析。放療和ΔFVII聯(lián)合治療顯著降低了RT誘導的纖維蛋白積累、MES細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變、TAM極化、整合素和NF-κB信號活性，但增加了C-Cas3+細胞數(shù)量（圖6A-D）。值得注意的是，在植入后38天接受聯(lián)合治療的小鼠的腦切片組織學檢查顯示，腫瘤細胞很少，纖維蛋白聚合物只有微弱的染色（圖6E）。研究者還通過D-二聚體和尾出血試驗確定了原位GBM腫瘤和ΔFVII對全身止血的影響（圖6F，G）。與皮下腫瘤結(jié)果類似，ΔFVII治療有效地抑制了RT-荷瘤小鼠的高凝狀態(tài)（圖6F，G）。最后，與對照組相比，單獨照射或ΔFVII單藥治療可使荷瘤小鼠的存活時間延長約10天（圖6H）。值得注意的是，接受聯(lián)合治療的組顯示出更大的生存延長，大約50%的小鼠存活，三個月后沒有可檢測到的腫瘤（圖6H）。

圖6 ΔFVII原位PDX模型中治療對GBM腫瘤的放射敏感性

7. 早期復發(fā)GBM患者的復發(fā)腫瘤具有衰老和凝血途徑的基因信號上調(diào)
       比較原發(fā)性和復發(fā)性GBM的匹配可以為治療誘導的表型腫瘤演變提供信息，包括GBM細胞狀態(tài)和TME成分之間的關(guān)聯(lián)。因此，研究者使用來自GLASS聯(lián)盟的數(shù)據(jù)集分析了RT治療的原發(fā)性GBM的轉(zhuǎn)錄譜，并將早期復發(fā)與晚期復發(fā)分離。通過代表性基因特征集的途徑富集分數(shù)推斷每個腫瘤的途徑激活狀態(tài)（圖7A，B）。研究者觀察到早期和晚期復發(fā)的原發(fā)腫瘤的特征基因集水平?jīng)]有顯著差異。然而，在比較復發(fā)的GBM時，研究者發(fā)現(xiàn)，與晚期復發(fā)的GBM相比，早期復發(fā)的GBM中M2巨噬細胞的預測存在以及衰老、凝血和NF-κB特征的富集明顯更高（圖7B）。此外，衰老、凝血和NF-κB特征的富集評分彼此高度相關(guān)，特別是在早期復發(fā)腫瘤對中（圖7C，D）。這些數(shù)據(jù)與研究者的結(jié)果一致，并可能為ΔFVII-based療法的潛在翻譯提供臨床相關(guān)性。
       研究者的數(shù)據(jù)共同支持了以前未確定的概念，即TIS期間F3信號的激活是觸發(fā)腫瘤細胞和TME中全局適應程序的核心啟動器，導致治療抵抗和腫瘤復發(fā)（圖7E）。

圖7 人類原發(fā)性和復發(fā)性GBM配對中衰老和凝血基因組的表達

結(jié)論
       該研究顯示，GBM中的F3信號是一個主動適應程序，以逃避治療壓力并利用TIS的致癌方面。因此，抑制F3信號可能是一種有希望的策略，可以顯著增強其他次優(yōu)的抗GBM治療。該發(fā)現(xiàn)可能為更好地理解F3信號提供了一步，這可能對推進治療策略至關(guān)重要。

實驗方法
酶聯(lián)免疫吸附檢測，熒光活化細胞分選，流式細胞術(shù)，單細胞RNA測序，ATAC測序，生物信息學分析，免疫熒光，免疫組織化學，免疫印跡，免疫共沉淀
參考文獻
Jeon HM, Kim JY, Cho HJ, Lee WJ, Nguyen D, Kim SS, et al. Tissue factor is a critical regulator of radiation therapy-induced glioblastoma remodeling. Cancer Cell. 2023 Aug 14;41(8):1480-1497.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2023.06.007.