腸道真菌通過抑制SAA1-GSDMD通路保護(hù)腸缺血再灌注損傷
欄目：最新研究動(dòng)態(tài)
發(fā)布時(shí)間：2024-03-12
本發(fā)現(xiàn)首次闡明了腸真菌在IIR損傷中發(fā)揮著重要作用。預(yù)防性抗真菌治療應(yīng)該考慮破壞真菌平衡......
背景
預(yù)防性抗真菌治療已廣泛應(yīng)用于危重癥患者，但未能改善患者預(yù)后，已成為研究熱點(diǎn)。這可能與真菌穩(wěn)態(tài)的破壞有關(guān)，但真菌的作用機(jī)制尚不清楚。腸缺血再灌注（IIR）損傷是危重癥患者的常見途徑，具有致命性，并受腸道菌群的調(diào)節(jié)。然而，腸道真菌在IIR損傷中的確切作用尚不清楚。
目的
這是一項(xiàng)臨床研究，旨在為闡明IIR損傷的潛在機(jī)制提供新的視角，并為未來IIR損傷的預(yù)防和治療提供潛在的策略。
方法
采用ITS測(cè)序檢測(cè)IIR損傷前后真菌的變化。分別用單真菌菌株、氟康唑和甘露聚糖預(yù)處理改變腸道真菌的組成。在IIR損傷小鼠模型中評(píng)估腸道形態(tài)和功能損傷。體外試驗(yàn)培養(yǎng)腸上皮MODE-K細(xì)胞和巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞。
結(jié)果
糞便真菌多樣性在IIR患者和小鼠中顯示出明顯的改變，并伴隨著腸上皮屏障功能障礙。真菌定植和甘露聚糖補(bǔ)充可通過抑制巨噬細(xì)胞SAA1的表達(dá)，減少腸上皮細(xì)胞焦亡，逆轉(zhuǎn)氟康唑加重的腸道形態(tài)和功能損傷。采用liposomal clodronate耗竭巨噬細(xì)胞數(shù)量，證明甘露聚糖的保護(hù)作用依賴于巨噬細(xì)胞的參與。
結(jié)論
本發(fā)現(xiàn)首次闡明了腸真菌在IIR損傷中發(fā)揮著重要作用。預(yù)防性抗真菌治療應(yīng)該考慮破壞真菌平衡。本研究為闡明長真菌在維持腸體內(nèi)平衡提供了新穎的線索。
本研究于2023年9月發(fā)表在《Journal of Advanced Research》上，IF：10.7。
技術(shù)路線
主要研究內(nèi)容
1、IIR損傷患者和小鼠的腸道真菌分布表征
為證實(shí)患者的IIR損傷已發(fā)生，作者評(píng)估了患者在首次血液透析過程中SMA形態(tài)和血流量的變化。血液透析2 h后，SMA血流的線性參數(shù)和容積參數(shù)降低（圖1A）。另外，在血液透析前2 h和血液透析后24 h采用ELISA法檢測(cè)IIR損傷的腸屏障相關(guān)生物標(biāo)志物。觀察到I-FABP和ZO-1水平顯著增加，但瓜氨酸值在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間降低（圖1B）。
考慮到腸道真菌在維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)中的潛在重要作用，作者在IIR損傷前（Before）和IIR損傷后（After）兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集了IIR損傷患者的糞便樣本。然后，選取配對(duì)的糞便樣本，使用ITS測(cè)序探索真菌的多樣性、豐富度和組成。不同的alpha多樣性指數(shù)包括Chao，Shannon和Shannoneven顯示出相似的趨勢(shì)，表明微生物組樣品內(nèi)的多樣性差異顯著（圖1C）。同樣，微生物組樣品之間的多樣性（β多樣性）顯示，兩個(gè)聚類相對(duì)分離，表明兩組之間的真菌結(jié)構(gòu)存在差異（圖1D）。此外，兩組均進(jìn)行了目和屬水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Saccharomycetales和Candida顯著降低（圖1E）。作者通過LEfSe分析從門到屬水平探究物種特征（LDA > 4），同樣發(fā)現(xiàn)Saccharomyces的豐度顯著降低（圖1F）。進(jìn)一步，作者評(píng)估了真菌豐度與IIR損傷的腸道屏障相關(guān)生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性。假絲酵母和Saccharomyces相對(duì)豐度與瓜氨酸水平呈正相關(guān)，與I-FABP和ZO-1水平呈負(fù)相關(guān)（圖1G-H）。
為獲得IIR損傷和腸真菌的直接相關(guān)性，作者在消除血液透析過程中其他因素影響的同時(shí)，建立了IIR小鼠模型，收集損傷前和損傷后的糞便并進(jìn)行ITS測(cè)序。在屬水平上的Alpha多樣性分析顯示兩組之間沒有差異（圖1I），而與損傷前小鼠相比，IIR小鼠的Beta多樣性分析顯示出獨(dú)立的簇（圖1J）。LEfSe分析顯示，（LDA > 2）小鼠IIR損傷后Saccharomyces減少（圖1K）。隨機(jī)森林分析的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了IIR小鼠的真菌組成發(fā)生了顯著的變化，表現(xiàn)為Saccharomyces的顯著減少和隨后的網(wǎng)孢菌屬的增加（圖1L）。進(jìn)一步，作者研究了真菌與腸道屏障相關(guān)生物標(biāo)志物和組織細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性。在IIR損傷后，I-FABP、KC、IL18、IL6、TNF-α、GCSF和IL1 β的水平顯著增加，與Saccharomyces的豐度呈負(fù)相關(guān)（圖1M）。
圖1 IIR模型中腸真菌的特征
2、單菌種的定殖減輕了IIR損傷
上述結(jié)果表明，在IIR過程中，酵母菌和假絲酵母（屬的分類學(xué)水平）顯著減少，這與IIR損傷有關(guān)。因此，作者旨在通過真菌定植實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些真菌與IIR損傷的相關(guān)性。值得注意的是，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae）和熱帶念珠菌（C. tropicalis）分別屬于S. cerevisiae屬（Saccharomyces）和假絲酵母屬（Candida），是人和小鼠腸道的優(yōu)勢(shì)定殖菌。此外，S. cerevisiae和C. tropicalis在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著不可替代的作用。在作者的研究中，S. cerevisiae和C. tropicalis在小鼠腸道中普遍存在，在建立IIR損傷模型之前，通過口服灌胃的方式定植于小鼠腸道（圖2A）。2周后，C. tropicalis和S. cerevisiae增加且不影響其他真菌的豐度，證明定殖成功（圖2B）。此外，在處死小鼠前進(jìn)行異硫氰酸熒光素葡聚糖跨上皮滲透性測(cè)定。作者發(fā)現(xiàn)定植組血清中異硫氰酸熒光素葡聚糖濃度顯著降低（圖2C）。作者通過血清I-FABP檢查、腸道組織H & E染色和組織學(xué)評(píng)分進(jìn)一步證實(shí)，腸道屏障破壞減輕，這與功能變化一致（圖2D，E）。Western blotting檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)（圖2F）。GSDMD蛋白的N端（P30）片段是焦亡效應(yīng)分子，作者證明了在IIR損傷的腸道中P30 GSDMD裂解增加（圖2F）。此外，多種細(xì)胞因子呈現(xiàn)一致的下降趨勢(shì)，尤其是與細(xì)胞焦亡相關(guān)的細(xì)胞因子（IL1β）（圖2G）。以上結(jié)果證實(shí)，增加S. cerevisiae和C. tropicalis負(fù)荷可減輕IIR損傷。
為進(jìn)一步證明腸道真菌可以直接影響宿主，而不是調(diào)節(jié)體內(nèi)的其他菌株，采用上述處理的無菌的（GF）小鼠建立IIR模型。通過真菌平板培養(yǎng)和柵欄定量豐度測(cè)試鑒定了S. cerevisiae和C. tropicalis混合物處理的無菌的小鼠的糞便真菌豐度（圖2H）。結(jié)果證實(shí)GF小鼠腸道內(nèi)真菌缺失，且定植成功。重要的是，根據(jù)上述方法檢測(cè)了IEB功能和形態(tài)，作者發(fā)現(xiàn)GF小鼠中的真菌定植也減輕了IIR損傷（圖2I-K）。這證明S. cerevisiae和C. tropicalis通過直接作用于宿主而不受腸道中其他細(xì)菌或其他微生物的干擾，從而減輕IIR損傷。因此，作者得出，增加S. cerevisiae和C. tropicalis可以緩解IIR損傷。
圖2 單菌種的定殖減輕了IIR損傷
3、預(yù)防性抗真菌治療加重小鼠IIR損傷
探討S. cerevisiae和C. tropicalis的減少是否會(huì)加重IIR損傷。小鼠飲用抗真菌藥物氟康唑0.5 mg/mL預(yù)處理2周，隨后進(jìn)行IIR損傷程序（圖3A）。進(jìn)行真菌豐度定量分析以評(píng)估真菌清除率（圖3B）和超高效液相色譜法檢測(cè)體內(nèi)血清氟康唑濃度（圖3C）。此外，通過血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試驗(yàn)來確定氟康唑的毒性作用，表明氟康唑在醫(yī)學(xué)上沒有毒性，不會(huì)加重?fù)p傷（圖3D）。使用先前描述的方法測(cè)量腸道功能和形態(tài)，并通過真菌清除獨(dú)立惡化IEB的損傷（圖3E-G）。此外，腸道組織中GSDMD的裂解和細(xì)胞因子的表達(dá)均有不同程度的升高（圖3H，I）。這些結(jié)果表明S. cerevisiae和C. tropicalis的清除加劇了GSDMD的裂解，促進(jìn)了細(xì)胞因子的釋放。
為驗(yàn)證真菌清除直接影響宿主，而不是氟康唑本身，作者采用上述方法對(duì)GF小鼠進(jìn)行氟康唑治療。通過檢測(cè)腸道功能和形態(tài)學(xué)，作者發(fā)現(xiàn)氟康唑本身并沒有加重IIR損傷。氟康唑處理后，血清異硫氰酸熒光素葡聚糖和I-FABP水平無明顯變化（圖3J，K）。這些結(jié)果證實(shí)，由于S. cerevisiae和C. tropicalis的缺失，氟康唑預(yù)處理GF小鼠并沒有通過真菌清除加重IIR損傷。
圖3 預(yù)防性抗真菌治療加重小鼠IIR損傷
4、腸道真菌對(duì)GSDMD-/ -小鼠失去保護(hù)作用
作者前期發(fā)現(xiàn)腸道真菌主要通過抑制GSDMD裂解發(fā)揮抗膿毒癥作用，由于腸道真菌清除加劇了GSDMD裂解，而在IIR損傷模型中，S. cerevisiae和C. tropicalis定植能夠緩解GSDMD裂解，因此作者試圖研究腸道真菌是否主要通過抑制GSDMD裂解發(fā)揮對(duì)小鼠IIR損傷的保護(hù)作用。因此，作者使用GSDMD-/ -小鼠，通過氟康唑預(yù)處理清除腸道真菌來驗(yàn)證作者的假設(shè)，如前所述（圖4A），Western blotting證實(shí)GSDMD在GSDMD-/ -小鼠中消失（圖4B）。為了驗(yàn)證GSDMD-/ -小鼠糞便中的真菌多樣性是否與WT組一致，進(jìn)行了真菌豐度的定量分析，與WT對(duì)照組相比，GSDMD-/ -小鼠的腸道中沒有觀察到真菌負(fù)荷的差異（圖4C）。此外，為了證實(shí)GSDMD-/ -小鼠的真菌清除是否可以改變IEB的形態(tài)和功能，作者測(cè)定了血清中異硫氰酸熒光素葡聚糖和I-FABP的濃度、腸黏膜損傷評(píng)分和上皮緊密連接蛋白的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)GSDMD-/ -小鼠的真菌負(fù)荷減少并沒有惡化屏障損傷（圖4D-G）。此外，腸道組織上清液中的細(xì)胞因子水平也沒有差異（圖4H）。此外，與WT對(duì)照組相比，GSDMD-/ -小鼠的IIR損傷顯著降低。因此，作者得出結(jié)論，在GSDMD-/ -小鼠中減少S. cerevisiae和C. tropicalis的真菌負(fù)荷并不能加重IIR損傷，而這些真菌通過抑制GSDMD裂解來減輕IIR損傷。
圖4 腸道真菌清除不會(huì)加劇GSDMD-/-小鼠的GSDMD裂解
5、甘露醇復(fù)制釀酒葡萄球菌喝熱帶葡萄球菌對(duì)IIR損傷的保護(hù)作用
鑒于S. cerevisiae和C. tropicalis對(duì)IIR損傷的緩解作用，作者研究了這些真菌是否具有共同的活性物質(zhì)。值得注意的是，S. cerevisiae和C. tropicalis是兩種具有相同結(jié)構(gòu)成分的酵母，即甘露聚糖，它是酵母細(xì)胞壁和周質(zhì)空間的主要組成部分。此外，大量研究表明甘露聚糖單獨(dú)提供免疫保護(hù)。作者前期發(fā)現(xiàn)甘露聚糖可以抑制GSDMD的裂解。為確認(rèn)甘露聚糖是否是S. cerevisiae和C. tropicalis保護(hù)IIR損傷的關(guān)鍵成分，C57/B6小鼠在IIR損傷模型前用甘露聚糖（0.1 mg / mL）預(yù)處理2周，通過他們的飲水（圖5A）。有趣的是，通過比較腸道形態(tài)和功能，IEB結(jié)構(gòu)和功能得以保留，與單真菌菌株定植的作用一致（圖5B-F），以及GSDMD裂解和細(xì)胞因子表達(dá)的水平一致（圖5D，F(xiàn)）。這一結(jié)果證實(shí)了S. cerevisiae和C. tropicalis在IIR損傷中的作用可能與甘露聚糖有關(guān)。同時(shí)，GF小鼠也用甘露醇處理，進(jìn)行IIR損傷評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示GF小鼠對(duì)IIR損傷具有相同的保護(hù)作用（圖5G-I）。
圖5 甘露醇復(fù)制IIR損傷中腸道真菌的保護(hù)作用
6、甘露聚糖在IIR損傷中的保護(hù)作用依賴于巨噬細(xì)胞的參與
為了進(jìn)一步研究甘露聚糖與宿主之間的相互作用，作者將Cyanine3（Cy3）熒光標(biāo)記物共價(jià)連接到甘露聚糖上（圖6A），發(fā)現(xiàn)小鼠口服灌胃后，甘露聚糖僅與F4 / 80標(biāo)記的巨噬細(xì)胞共定位（圖6B）。這一結(jié)果表明，甘露聚糖在進(jìn)入腸道后被巨噬細(xì)胞識(shí)別并發(fā)生相應(yīng)作用。在體外，將Cy3-甘露聚糖加入到RAW264.7細(xì)胞中，顯示甘露聚糖在孵育6 h后進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞（圖6B）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示甘露聚糖可以減少腸道中巨噬細(xì)胞（F4 / 80 + CD45.2 +）的數(shù)量。為進(jìn)一步證明甘露聚糖的保護(hù)作用與巨噬細(xì)胞有關(guān)，在建立IIR模型前3天腹腔注射liposomal clodronate，以清除腸道中的巨噬細(xì)胞（圖6C）。結(jié)果表明，liposomal clodronate減少了腸道中巨噬細(xì)胞的數(shù)量。比較腸道形態(tài)和功能發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞清除后，甘露聚糖的保護(hù)作用減弱，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6D-G）。同時(shí)，IIR損傷引起的GSDMD裂解和細(xì)胞因子表達(dá)水平也有所減輕，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6G-H）。這些結(jié)果表明甘露聚糖通過巨噬細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。
圖6 IIR損傷中甘聚糖的保護(hù)作用依賴于巨噬細(xì)胞的參與
7、單菌株和甘露聚糖均可通過降低巨噬細(xì)胞SAA1的表達(dá)來緩解GSDMD裂解
為進(jìn)一步探索S. cerevisiae和C. tropicalis通過巨噬細(xì)胞減輕IIR損傷的關(guān)鍵途徑，作者在建立IIR損傷模型之前，對(duì)單菌株或甘露聚糖處理的小鼠腸道組織進(jìn)行了RNA-Seq。作者在RNA-Seq結(jié)果中發(fā)現(xiàn)血清淀粉樣蛋白a1（SAA1）水平顯著降低，并使用qPCR獨(dú)立驗(yàn)證mRNA表達(dá)（圖7A，B）。SAA1是一種急性時(shí)相蛋白，已被證明與急性炎癥密切相關(guān)，并加重多種炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展。為了檢測(cè)SAA1蛋白在腸道中的表達(dá)分布，作者進(jìn)行了免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示SAA1主要在腸道內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而在預(yù)處理的小鼠中SAA1的表達(dá)明顯較少（圖7C）。此外，免疫熒光染色檢測(cè)到F4 / 80標(biāo)記的腸巨噬細(xì)胞中SAA1蛋白表達(dá)下降（圖7D）。為了證實(shí)甘露聚糖在體外是否可以降低SAA1，用甘露聚糖（1mg/mL）處理RAW264.7細(xì)胞6 h，然后移至含1 μg/mL脂多糖類（LPS）的培養(yǎng)基中孵育2 h，用于增加SAA1的基礎(chǔ)表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)SAA1在的mRNA和蛋白水平表達(dá)均降低（圖7E，F(xiàn)）。這一結(jié)果與作者發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞參與甘露聚糖的保護(hù)作用一致，證明甘露聚糖通過減少巨噬細(xì)胞SAA1分泌發(fā)揮保護(hù)作用。
作者先前的工作已經(jīng)證明了甘露聚糖可減少IIR損傷中GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。越來越多的證據(jù)表明，SAA1與GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。此外，作者通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GSDMD主要在IIR損傷時(shí)的IECs中表達(dá)（圖3）。因此，作者使用SAA1蛋白（600 ng/mL）處理的小鼠腸上皮細(xì)胞（MODE-K）在氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）模型中，進(jìn)一步證明SAA1在體外直接加劇GSDMD裂解（圖7G）。此外，由于SAA1蛋白刺激（圖7G，H），緊密連接蛋白也表現(xiàn)出明顯的損傷。利用qPCR檢測(cè)SAA1處理MODE-K細(xì)胞后GSDMD、NLRP3、IL1 β、IL18、Caspase-1和Caspase-11的mRNA表達(dá)（圖7H）。這些結(jié)果提示GSDMD裂解的加劇可能是GSDMD和NLRP3表達(dá)上調(diào)所致。綜上所述，腸道真菌通過降低巨噬細(xì)胞中SAA1的表達(dá)，從而緩解IECs中GSDMD的裂解，減輕IIR損傷損傷。
圖7 單菌株和甘露聚糖均可通過降低巨噬細(xì)胞SAA1的表達(dá)來緩解GSDMD裂解
結(jié)論
本研究結(jié)果提示，IIR損傷后腸道真菌發(fā)生紊亂。S. cerevisiae和C. tropicalis具有通過甘露聚糖抑制巨噬細(xì)胞中SAA1的表達(dá)和減少IECs中GSDMD切割來減輕IIR損傷的潛力。本研究揭示了血液透析中IIR損傷的新機(jī)制，并提示維持腸道真菌穩(wěn)態(tài)可能是預(yù)防IIR損傷的新療法。
實(shí)驗(yàn)方法
臨床樣本收集，腸系膜上動(dòng)脈（SMA）超聲檢查，ITS1 sequencing，C57BL/6J小鼠，IIR小鼠模型構(gòu)建，真菌DNA提取，ELISA試劑盒檢測(cè)腸道功能的特殊生物標(biāo)志物，超高效液相色譜，H&E染色，血清細(xì)胞因子檢測(cè)，Western blot assay，免疫組化染色分析SAA1和GSDMD的水平，免疫熒光，RNA-seq，PCR分析
參考文獻(xiàn)
Chen Y, Han B, Guan X, Du G, Sheng B, Tang X, Zhang Q, Xie H, Jiang X, Tan Q, Chen S, Wang J, Chen W, Xiao W. Enteric fungi protect against intestinal ischemia-reperfusion injury via inhibiting the SAA1-GSDMD pathway. J Adv Res. 2023 Sep 15:S2090-1232（23）00258-8. doi: 10.1016/j.jare.2023.09.008. Epub ahead of print. PMID: 37717911.