自噬基因ATG16L1的腫瘤內(nèi)在表達(dá)抑制了結(jié)直腸癌的抗腫瘤免疫

       近年來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）如抗PD-1、PD-L1和CTLA-4的單克隆抗體已被證明在許多癌癥類型中具有臨床療效。然而迄今為止，只有一小部分結(jié)直腸癌（CRC）患者對(duì)ICI有應(yīng)答。因此，揭示MSS-CRC中ICI耐藥的決定因素對(duì)于通過新型治療組合解鎖抗腫瘤免疫至關(guān)重要。炎癥性腸病的全基因組關(guān)聯(lián)研究揭示了與腸道炎癥增加相關(guān)的關(guān)鍵通路。其中，調(diào)節(jié)caspase介導(dǎo)的降解的核心自噬基因ATG16L1的一個(gè)錯(cuò)義變異體被確定為克羅恩病的高度顯著風(fēng)險(xiǎn)等位基因，以及CRC14和胃癌的推測(cè)預(yù)后因素。ATG16L1是自噬分解代謝過程所需的e3連接酶樣自噬體延伸復(fù)合體的關(guān)鍵成分。自噬在腸上皮細(xì)胞適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。此外，自噬通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)固有和適應(yīng)性免疫，包括抗原呈遞、效應(yīng)T細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡。最近使用腫瘤細(xì)胞系模型的研究表明，核心自噬通路的成員是免疫抑制的腫瘤內(nèi)源性或外源性決定因素，但它們的轉(zhuǎn)化相關(guān)性仍不清楚。該研究發(fā)表在《Nature Communications》，IF：16.6。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. ATG16L1表達(dá)升高預(yù)測(cè)攜帶致癌性KRAS突變的CRC患者免疫治療反應(yīng)差
       為了評(píng)估ATG16L1表達(dá)是否與非MSI CRC對(duì)ICI的應(yīng)答相關(guān)，研究者評(píng)估了IMblaze370的腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)。研究者比較了抗PD-L1單藥治療與抗PD-L1與MAP激酶通路抑制劑考比替尼聯(lián)合治療。瑞戈非尼單藥治療被用作標(biāo)準(zhǔn)治療對(duì)照組。
       對(duì)非高M(jìn)SI腫瘤中的ATG16L1轉(zhuǎn)錄水平所做的分析表明，在KRAS突變型腫瘤中，在阿替利珠單抗和阿替利珠單抗+考比替尼聯(lián)合治療組中，ATG16L1表達(dá)水平升高均與較差的總生存期相關(guān)，但在KRAS野生型腫瘤中未見相關(guān)（圖1a）。相反，在瑞戈非尼組中，ATG16L1轉(zhuǎn)錄水平與有差異的結(jié)局無關(guān)（圖1a）。ATG16L1表達(dá)與腫瘤上皮標(biāo)簽呈正相關(guān)，與免疫和間質(zhì)標(biāo)簽呈負(fù)相關(guān)，提示ATG16L1表達(dá)的主要來源是腫瘤細(xì)胞（圖1b）。IMblaze370腫瘤樣本的組織病理學(xué)評(píng)估顯示，ATG16L1蛋白水平主要在腫瘤上皮內(nèi)升高，少量位于腫瘤間質(zhì)（圖1c）。人CRC腫瘤的單細(xì)胞基因表達(dá)分析證實(shí)，與CRC腫瘤微環(huán)境的其他細(xì)胞區(qū)室相比，腫瘤上皮中的ATG16L1轉(zhuǎn)錄水平升高（圖1d，e）。
       接下來，研究者研究了KRAS狀態(tài)是否與ATG16L1低表達(dá)和高表達(dá)腫瘤的轉(zhuǎn)錄譜差異相關(guān)。使用CIBERSORT40進(jìn)行的免疫細(xì)胞去卷積分析顯示，ATG16L1低表達(dá)的腫瘤顯示了KRAS突變環(huán)境中T細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤增加的明顯更強(qiáng)證據(jù)（圖1f）。因此，在KRAS突變患者中，接受免疫治療的ATG16L1低表達(dá)患者的生存改善與T細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤增加相關(guān)。綜上，在非MSI CRC中，ATG16L1低水平腫瘤患者可能會(huì)產(chǎn)生更炎癥的微環(huán)境，從而在阿替利珠單抗檢查點(diǎn)抑制時(shí)促進(jìn)產(chǎn)生高效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

圖1 在攜帶致癌性KRAS突變的非高微衛(wèi)星不穩(wěn)定型結(jié)直腸癌患者中，ATG16L1表達(dá)升高與免疫治療的不良結(jié)局相關(guān)

2. 腫瘤內(nèi)源性ATG16L1促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞免疫抵抗
       在晚期CRC中，ATG16L1表達(dá)水平升高與不良結(jié)局相關(guān)，這一觀察結(jié)果促使研究者從功能上評(píng)估了其在CRC進(jìn)展中的作用。首先，通過對(duì)小鼠結(jié)腸類器官進(jìn)行CRISPR-Cas9編輯，研究者開發(fā)了攜帶在MSS-CRC中觀察到的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)突變的腫瘤模型。研究者依次引入了腫瘤抑制因子Apc、Trp53、Smad4的功能缺失和Kras的致癌功能獲得，以生成轉(zhuǎn)化的CRC類器官（AKPS，圖2a）。ATG16L1通過脂化LC3/ATG8家族的泛素樣蛋白16來驅(qū)動(dòng)自噬體延伸。在ATG16L1敲除的CRC類器官克隆中，研究者證實(shí)了脂質(zhì)化LC3b的完全缺失（圖2b）。一類稱為sequestosome樣受體（SLRs）的蛋白質(zhì)的累積是自噬流缺陷和ATG16L1缺失的標(biāo)志。與lc3-ⅱ缺失一致，與對(duì)照（WT）CRC類器官相比，ATG16L1敲除（KO）中SLRs SQSTM1/p62和CALCOCO1水平升高（圖2b）。
       結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肝和肺。研究者分別使用改良的水動(dòng)力尾靜脈注射方案和傳統(tǒng)的靜脈尾靜脈注射將CRC類器官直接輸送到肝臟和肺。將CRC類器官原位注射到結(jié)腸上皮中用于在原發(fā)疾病龕中建立腫瘤。通過生物發(fā)光（BLI）成像觀察穩(wěn)定表達(dá)的熒光素酶報(bào)告基因在肝和肺模型中的腫瘤生長(zhǎng)情況。在完全免疫正常的宿主中，ATG16L1缺失顯著降低了肝臟腫瘤負(fù)荷（圖2c，d，i）。接種后6周，給予WT CRC類器官的小鼠的肝臟顯示出廣泛的疾病負(fù)擔(dān)，而給予ATG16L1 KO CRC類器官的少數(shù)小鼠僅出現(xiàn)偶爾的腫瘤灶（圖2i）?？傊芯空叩臄?shù)據(jù)表明ATG16L1促進(jìn)免疫正常小鼠的CRC生長(zhǎng)，而不依賴于組織生態(tài)位。由于IMblaze370研究了轉(zhuǎn)移后CRC的患者結(jié)局，因此研究者的后續(xù)實(shí)驗(yàn)側(cè)重于CRC類器官的肝臟定植。
       ATG16L1缺失不影響體外AKPS類器官的基礎(chǔ)生長(zhǎng)，這提示腫瘤內(nèi)在的ATG16L1缺失可能引發(fā)體內(nèi)控制疾病的腫瘤外源性機(jī)制。研究者將WT和ATG16L1 KO CRC類器官植入免疫受損宿主的肝臟（圖2e-h）。NOD/SCID-gamma IL2Rgnull（NSG）小鼠是研究人類腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的常用小鼠。與細(xì)胞免疫在控制腫瘤生長(zhǎng)中的作用一致，野生型CRC類器官在NSG宿主中比免疫正常的BL6小鼠生長(zhǎng)更快。值得注意的是，ATG16L1 KO CRC類器官在NSG宿主中快速生長(zhǎng)（圖2e，h），并且在免疫正常的對(duì)照BL6宿主中達(dá)到與WT CRC類器官相同的程度（圖2d）。雖然ATG16L1 KO組的腫瘤負(fù)荷與WT組相比仍然顯著降低，但給予ATG16L1 KO CRC類器官的所有NSG小鼠均表現(xiàn)出較大的腫瘤結(jié)節(jié)（圖2j）。
       為了進(jìn)一步完善這些觀察結(jié)果，研究者分別去除宿主細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞或自然殺傷（NK）細(xì)胞，然后植入CRC類器官。有趣的是，耗竭NK細(xì)胞顯著恢復(fù)了ATG16L1 KO CRC類器官的生長(zhǎng)，而耗竭CD8+T細(xì)胞無顯著影響（圖2f，h）。因此，NK細(xì)胞似乎是清除ATG16L1缺陷的MSS-CRC的關(guān)鍵因素。
       接下來，研究者使用Ifng KO小鼠研究IFNγ是否參與腫瘤控制，IFNγ是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞效應(yīng)功能的關(guān)鍵細(xì)胞因子。與野生型對(duì)照宿主相比（圖2d），如BLI定量所示，宿主IFNγ缺失顯著增加了ATG16L1 KO CRC類器官的肝臟定植（圖2g，h），提示宿主IFNγ在體內(nèi)抑制ATG16L1缺陷型CRC類器官的生長(zhǎng)?？傮w而言，研究者觀察到ATG16L1缺陷的CRC類器官在免疫受損宿主的肝臟中生長(zhǎng)改善（圖2h）。研究者的結(jié)果表明，不依賴于組織生態(tài)位，腫瘤固有的ATG16L1極大地限制了CRC的免疫介導(dǎo)控制。而當(dāng)腫瘤在免疫缺陷宿主中生長(zhǎng)時(shí)，其影響相對(duì)較小。

圖2 ATG16L1通過促進(jìn)細(xì)胞免疫抵抗來驅(qū)動(dòng)肝內(nèi)CRC生長(zhǎng)

3. ATG16L1的缺失改變了CRC類器官的組成和表型
       為了更好地理解ATG16L1如何影響腫瘤及其微環(huán)境中細(xì)胞的表型編程，研究者對(duì)植入NSG小鼠肝臟中的腫瘤進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，因?yàn)锳TG16L1 KO CRC類器官的最佳生長(zhǎng)需要免疫缺陷宿主。收集腫瘤并將活細(xì)胞分選為CRC類器官和白細(xì)胞組分。通過單細(xì)胞RNA測(cè)序分析每組的分選部分。對(duì)類器官細(xì)胞和免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行預(yù)處理和標(biāo)準(zhǔn)化。將類器官細(xì)胞和免疫細(xì)胞池分別過濾，僅保留上皮細(xì)胞和髓樣細(xì)胞。
       研究者首先聚焦于腫瘤固有狀態(tài)，其中無監(jiān)督圖聚類揭示了上皮CRC細(xì)胞的8個(gè)簇：增殖（Prolif.），分泌/感覺（SS），成熟腸細(xì)胞（ME），神經(jīng)內(nèi)分泌（NE），腸祖細(xì)胞，干擾素反應(yīng)（IFN），StemHI和Goblet/Paneth（GP）細(xì)胞簇（圖3a，b）。
       細(xì)胞類型比例的比較表明，ATG16L1缺失顯著改變了體內(nèi)CRC類器官細(xì)胞的組成（圖3c-e）。在ATG16L1 KO組中，IFN反應(yīng)性CRC細(xì)胞的比例顯著增加，指向依賴自噬的腫瘤固有免疫抑制過程（圖3e）。ATG16L1 KO組的NE和SS反應(yīng)簇也呈比例增加（圖3e）。相比之下，在ATG16L1 KO組中，GP細(xì)胞的比例顯著降低，突顯了ATG16L1在維持杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞身份方面的重要作用（圖3e）。最后，ATG16L1缺失導(dǎo)致StemHI和增殖細(xì)胞簇成比例減少（圖3e）。
       ATG16L1缺失也改變了每個(gè)簇內(nèi)CRC類器官細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)?；蚣患治鲲@示，除了顯著增加的IFN反應(yīng)簇外，在ATG16L1 KO組中，StemHI和GP細(xì)胞簇也表現(xiàn)出更高水平的IFN反應(yīng)基因，這與炎癥性腫瘤微環(huán)境的產(chǎn)生、腫瘤對(duì)IFN的內(nèi)在敏感性增加或兩者的某種組合一致（圖3f）。此外，在ATG16L1缺失后，除IFN應(yīng)答簇外，所有簇均顯示上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因水平升高（圖3f）?？紤]到與EMT樣特征密切相關(guān)的NE簇的比例增加，這一結(jié)果凸顯了EMT是ATG16L1 KO條件中最顯著的變化之一。以上結(jié)果表明，即使在免疫功能低下的NSG宿主中，TME也可能通過增強(qiáng)IFN反應(yīng)對(duì)ATG16L1缺陷腫瘤施加選擇性壓力。
       研究者接下來的問題是，在體內(nèi)植入的ATG16L1缺陷腫瘤中觀察到的轉(zhuǎn)錄變化中，哪些是真正的腫瘤固有的。為了嚴(yán)格關(guān)注ATG16L1的腫瘤內(nèi)在效應(yīng)，研究者對(duì)體外培養(yǎng)的WT和ATG16L1 KO CRC類器官進(jìn)行了批量RNA-seq分析。對(duì)單細(xì)胞來源的細(xì)胞簇的前100個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行GSEA分析，發(fā)現(xiàn)ATG16L1缺失導(dǎo)致Prolif的表達(dá)顯著降低。和GP簇標(biāo)志物，以及SS簇標(biāo)志物表達(dá)增加（圖3g，h），表明這些是腫瘤細(xì)胞中ATG16L1缺失導(dǎo)致的直接變化。相比之下，其他簇的變化顯然是由TME介導(dǎo)的（圖3e-g）?？傊?，這些數(shù)據(jù)提示，ATG16L1缺失導(dǎo)致CRC類器官中的杯狀細(xì)胞、帕內(nèi)特細(xì)胞、干細(xì)胞和增殖池減少，可能抑制腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)，增強(qiáng)的IFN反應(yīng)性可能增加抗腫瘤免疫壓力。

圖3 ATG16L1的腫瘤內(nèi)在缺失改變了肝臟中CRC細(xì)胞的表型和組成

4. 結(jié)直腸癌類器官中ATG16L1的缺失重塑了腫瘤髓系隔室
       接下來，研究者探討了腫瘤內(nèi)在ATG16L1缺失如何影響造血腫瘤微環(huán)境。由于ATG16L1 KO CRC類器官在免疫正常的BL6宿主中未形成腫瘤，因此研究者的分析僅限于NSG宿主中生長(zhǎng)的腫瘤的髓系室。在本研究中，研究者對(duì)NSG小鼠肝臟內(nèi)種植的WT和ATG16L1 KO腫瘤分選的髓系細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq分析，這些髓系細(xì)胞分為10個(gè)簇（圖4a，b）。巨噬細(xì)胞亞群包括TREM2+、VSIG4+、MARCO+和ifn反應(yīng)性巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞的混合簇。樹突狀細(xì)胞聚集成cDC1、cDC2、CCR7+DC和漿細(xì)胞樣DC。另外兩種不同的細(xì)胞群是單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。在CRC類器官中ATG16L1的缺失導(dǎo)致了髓系室的實(shí)質(zhì)性重塑。ATG16L1 KO組單核細(xì)胞以及TREM2+和VSIG4+巨噬細(xì)胞亞群顯著減少（圖4c-e）。ATG16L1缺失后，中性粒細(xì)胞募集增強(qiáng)，這與即使在NSG宿主中炎癥活動(dòng)增加一致（圖4e）。正如無偏倚GSEA分析中IFN反應(yīng)特征的增加所表明的那樣，大多數(shù)巨噬細(xì)胞和DC亞群顯示了復(fù)極化進(jìn)入炎癥狀態(tài)的證據(jù)（圖4f）。IFN反應(yīng)的混合巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞簇的百分比顯著增加（圖4e），并且在ATG16L1 KO條件下表現(xiàn)出更強(qiáng)的IFN反應(yīng)（圖4f）。這些結(jié)果表明，腫瘤固有的ATG16L1缺失不僅重編程CRC細(xì)胞，而且導(dǎo)致髓系室向抗腫瘤狀態(tài)的促炎重塑。

圖4 腫瘤內(nèi)ATG16L1缺失可重編程腫瘤微環(huán)境中的髓系細(xì)胞組成和表型

5. ATG16L1保護(hù)CRC類器官免受TNF+ifnγ介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡
       細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞和IFNγ對(duì)ATG16L1 KO腫瘤的清除增加，以及NSG小鼠中ifn應(yīng)答基因標(biāo)簽的持續(xù)增強(qiáng)，促使研究者直接確定腫瘤內(nèi)源性ATG16L1在調(diào)節(jié)IFNγ信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。首先，在體外IFNγ刺激下對(duì)野生型和ATG16L1 KO型結(jié)直腸癌類器官進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。在IFNγ處理的CRC類器官中，ATG16L1的缺失顯著增強(qiáng)了IFN通路基因的表達(dá)（圖5a，b）。之前的研究表明，在高度轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系或原代腸上皮細(xì)胞中，自噬抑制使其對(duì)TNF或IFNγ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感，與之相反，IFNγ或TNF單獨(dú)在體外無法誘導(dǎo)CRC類器官死亡（圖5c，d）。然而，TNF和IFNγ聯(lián)合使用可誘導(dǎo)CRC類器官死亡。重要的是，ATG16L1的缺失顯著加速了TNF和IFNγ共同處理誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖5c，d）。
       接下來，研究者研究了參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的信號(hào)通路。有趣的是，重要的程序性壞死介質(zhì)RIPK3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白僅在ATG16L1 KO類器官中被磷酸化（圖5e）。在ATG16L1 KO CRC類器官中，Ripk3缺失部分挽救了TNF+ifnγ誘導(dǎo)的死亡，在ATG16L1和Ripk3雙重缺失的細(xì)胞中添加z-VAD可完全阻斷細(xì)胞死亡（圖5f）。抑制ATG16L1 KO類器官中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶可進(jìn)一步加速細(xì)胞死亡，這可能是通過RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死實(shí)現(xiàn)的，這與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在程序性壞死中的調(diào)節(jié)作用一致?？傊?，這些結(jié)果表明ATG16L1的缺失使CRC類器官對(duì)TNF+ifnγ誘導(dǎo)的程序性壞死和凋亡敏感。

圖5 ATG16L1缺失使CRC類器官對(duì)TNF+ifnγ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感

結(jié)論
       該研究表明，CRC中ATG16L1的高表達(dá)預(yù)示著較差的免疫治療應(yīng)答，這在機(jī)制上可以通過ATG16L1介導(dǎo)的IFN信號(hào)傳導(dǎo)抑制和隨后的細(xì)胞免疫抑制來解釋。這為在晚期MSS-CRC中通過抑制自噬來克服免疫療法耐藥提供了治療理論依據(jù)，而MSS-CRC是一種可選擇的治療方案有限、臨床結(jié)局不佳且未滿足的需求高的疾病。

實(shí)驗(yàn)方法
生物發(fā)光成像，蛋白質(zhì)印跡，流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞死亡測(cè)定，免疫組織化學(xué)染色，全外顯子組測(cè)序，TCGA分析，生存分析，單細(xì)胞RNA測(cè)序
參考文獻(xiàn)
Taraborrelli L, ?enbabao?lu Y, Wang L, Lim J, Blake K, Kljavin N, et al. Tumor-intrinsic expression of the autophagy gene Atg16l1 suppresses anti-tumor immunity in colorectal cancer. Nat Commun. 2023 Sep 23;14(1):5945. doi: 10.1038/s41467-023-41618-7.