膀胱癌中TRMT6 / 61A依賴的堿基甲基化調(diào)控基因沉默活性和未折疊蛋白反應(yīng)
RNA修飾是RNA功能的重要調(diào)控元件。然而，大多數(shù)RNA修飾的全基因組圖譜都集中在信使RNA和轉(zhuǎn)移RNA上，但缺乏小RNA的此類數(shù)據(jù)集。在這里，作者繪制了細(xì)胞小RNA空間中的N1 -甲基腺苷（m1 A）。以合成的m1 - A RNA為基準(zhǔn)，作者的工作流程確定了含有m1 - A的小RNA的特定組，否則不成比例地代表性不足。特別是，22個(gè)核苷酸長(zhǎng)的3 ' tRNA片段高度富集于位于種子區(qū)的trmt6 / 61a依賴性m1 A。TRMT6/ 61a依賴性m1 - A負(fù)性影響trf -3的基因沉默。在TRMT6/61A過表達(dá)的膀胱尿路上皮癌中，檢測(cè)到tRF上較高的m1 A修飾，與tRF靶組失調(diào)相關(guān)。最后，TRMT6/61A調(diào)節(jié)參與未折疊蛋白反應(yīng)的tRF-3靶點(diǎn)。總之，作者的研究結(jié)果揭示了通過小RNA的堿基修飾調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制。這篇文章于2022年4月發(fā)表于《Nature Communication》IF：16.6。
技術(shù)路線
技術(shù)路線圖
主要研究結(jié)果
1. 小RNA空間中m1A位點(diǎn)的系統(tǒng)制圖
已知m1A會(huì)中斷常規(guī)的沃森-克里克A:U堿基配對(duì)（圖1a），并在為HTS準(zhǔn)備文庫(kù)時(shí)導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）停滯。該特性可用于通過m1A位置的錯(cuò)配（錯(cuò)誤結(jié)合）來繪制m1A位點(diǎn)。為了系統(tǒng)地繪制小RNA（<50個(gè)核苷酸長(zhǎng)）中潛在的m1A位點(diǎn)，作者結(jié)合了兩種獨(dú)立的方法（圖1b）: m1A抗體富集，然后進(jìn)行小RNA測(cè)序（m1A- rip -seq）和m1A誘導(dǎo)的錯(cuò)配測(cè)序。為了首先確定用于標(biāo)準(zhǔn)小RNA測(cè)序的m1A兼容RT，使用具有單個(gè)m1A位點(diǎn)的合成小RNA測(cè)試了三種候選RT （protoscriptii -一種常用的M-MuLV RT，tgir -模板切換組II逆轉(zhuǎn)錄酶和工程HIV RT-1306）。選擇TGIRT和RT-1306進(jìn)行測(cè)試是基于它們之前在測(cè)序含有m1a的mRNA和tRNA方面的成功。實(shí)驗(yàn)流程（圖1c，左下）如下:小RNA先與3′端接頭連接，然后與5′端接頭連接，然后引物啟動(dòng)RT反應(yīng)生成cDNA，然后用覆蓋兩個(gè)接頭序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。作者的策略確保只有可讀取的產(chǎn)品將被克隆并用于下游的錯(cuò)配分析，以進(jìn)行m1A修改估計(jì)。通過在RT步驟之前包括5 '接頭連接，作者消除了由于與PCR擴(kuò)增的5 '引物缺乏互補(bǔ)性而導(dǎo)致任何RT延遲產(chǎn)物被克隆為截?cái)喈a(chǎn)物的可能性。這種方法對(duì)于小RNA是首先考慮的，因?yàn)樗鼈兺ǔＶ挥袔讉€(gè)堿基不同，特別是對(duì)于trf。例如，18-nt tRF-3和22-nt tRF-3已被證明通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)LTR功能。使用這一工作流程，合成m1A位點(diǎn)的錯(cuò)配指數(shù)（由A到T/G/C突變計(jì)算）對(duì)于TGIRT和RT-1306來說，在不同的m1A化學(xué)計(jì)量中都顯示出很高的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍（圖1c）。然而，當(dāng)m1A存在于<=60%的合成短RNA中時(shí)，通常用于短RNA測(cè)序的逆轉(zhuǎn)錄酶ProtoScriptII產(chǎn)生的錯(cuò)配率低于5%（圖1c）。與TGIRT和RT-1306相比，克隆頻率較低，當(dāng)100%的RNA具有m1A時(shí)可以看出（圖1d）。最后，當(dāng)與m1A抗體富集（m1A- rip）結(jié)合使用時(shí)，TGIRT和ProtoScriptII都能夠檢測(cè)到插入細(xì)胞小RNA的合成m1A RNA的富集（圖1e）?；谏鲜龇治?，作者選擇了TGIRT來進(jìn)一步鑒定內(nèi)源性m1A小RNA。
圖1小RNA空間中m1A位點(diǎn)的系統(tǒng)制圖
2. 特異性tRNA衍生片段高度富集于m1A
為了鑒定內(nèi)源性含有m1A的小RNA，將m1A RIP應(yīng)用于細(xì)胞中純化的短RNA。HEK293T細(xì)胞中m1A修飾的tRNA通過m1A RIP富集并洗脫成功（圖2a）。對(duì)于有一個(gè)堿基錯(cuò)配的tRF reads， m1A RIP的富集更為突出，可能是在m1A修飾的位點(diǎn)（圖2b）。在microRNAs或其他小RNA中，m1A RIP未觀察到這種錯(cuò)配相關(guān)的富集（圖2b）。在m1A RIP后，大多數(shù)含有錯(cuò)配的tRF讀取具有A到C/G/T不匹配（細(xì)胞質(zhì)tRF為90%，線粒體tRF為95%）（圖2b），表明修飾的（容易錯(cuò)配的）腺苷特異性富集，最有可能是m1A。
根據(jù)起始和結(jié)束位置，tRNA片段可以分為三組（圖2c）22，30，34:（1）映射到成熟tRNA的極端3 ' CCA端的tRF-3s，（2）映射到成熟tRNA的極端5 '端的tRF-5s，以及（3）包含前體tRNA的尾鏈序列（通常以poly-U結(jié)尾）的tRF-1s。成熟tRNA的3′端trf優(yōu)先被m1A抗體富集，而5′端trf相對(duì)microRNA輕度富集，tRF-1s不富集（圖2d， e）。此外，與18-nt tRF-3a相比，22-nt tRF-3b被m1A抗體特異性富集（圖2f），這表明只有22-nt而不是18-nt tRF-3s含有m1A。值得注意的是，tRF-3b（圖2f）的富集程度與峰值控制的m1A RNA（圖1e）相似。輸入樣品的TGIRT誤摻入特征也得到了m1A在特定trf -3上的位置和化學(xué)計(jì)量。在所有22 nt的tRF-3b的第四個(gè)位置（A4）觀察到最高的錯(cuò)配率（圖3b， c）。這種高錯(cuò)配率具有高度特異性:在tRF-3b的其他位置（圖3c）或18 nt的tRF-3a上沒有觀察到。有趣的是，一些microRNA被m1A RIP顯著富集（圖2d），但未能顯示位點(diǎn)特異性錯(cuò)配模式，因此作者在本報(bào)告中沒有將它們報(bào)道為真正的含有m1A的小RNA（在Discussion中進(jìn)一步討論）。這些都表明tRF-3b是含有m1a的小RNA。
由于確定的大多數(shù)m1A位點(diǎn)都處于高化學(xué)計(jì)量，因此作者跳過了m1A RIP，僅使用TGIRT錯(cuò)配特征來量化特定位點(diǎn)的m1A，以便進(jìn)行以下分析。
圖2特異性tRNA衍生片段高度富集于m1A
3. 22個(gè)核苷酸3 ' tRNA片段上的m1A依賴于TRMT6/61A
22-nt tRF-3b上的A4位置與成熟tRNA上的A58位置相對(duì)應(yīng)（圖3a）。胞質(zhì)tRNAs上的m1A58由異源二聚體酶復(fù)合物TRMT6/TRMT61A（或酵母中的GCD10/GCD14）催化。為了測(cè)試tRF-3b上的m1A是否由TRMT6/61A引入的修飾（可能在親本tRNA上），在TRMT6/61A敲低后評(píng)估了錯(cuò)誤合并特征（圖3b-e）。當(dāng)TRMT6/61A被敲除（圖3d）時(shí)，除了tRNAiMet中的trf -3外，m1a依賴的trf -3錯(cuò)結(jié)合在全球范圍內(nèi)減少（圖3b， c）。在HeLa和U251細(xì)胞中也觀察到siTRMT6/61A或單獨(dú)使用siTRMT61A的較低的tRF-3b A4錯(cuò)摻率（圖3f）。盡管TRMT6/61A敲除后，攜帶ProtoScriptII的tRF-3b的克隆頻率顯著增加，但Northern blots未檢測(cè)到tRF-3b和tRNA的穩(wěn)態(tài)水平有任何變化（圖3g）。這證實(shí)了攜帶m1a的小RNA在這種常用的ProtoScriptII RT中代表性不足。
圖3 22個(gè)核苷酸3 ' tRNA片段上的m1A依賴于TRMT6/61A
4. m1A減弱了trf -3的基因沉默
m1A在tRF-3上特定位置的存在提出了一種有趣的可能性，即它可能調(diào)節(jié)tRF-3的功能，特別是如果它涉及堿基配對(duì)或蛋白質(zhì)結(jié)合。已經(jīng)在多種生物學(xué)途徑中發(fā)現(xiàn)了trf -3，特別是依賴于引導(dǎo)小RNA（trf -3）與靶RNA之間堿基配對(duì)的基因沉默途徑（圖4a）。這些依賴ago的基因沉默機(jī)制可能受到tRF-3s 4位m1A的影響，該位置位于與目標(biāo)RNAs25，45堿基配對(duì)所必需的種子區(qū)。
為了直接測(cè)試m1A對(duì)tRF-3b基因沉默活性的影響，作者生成了雙熒光素酶報(bào)告基因，在Renilla熒光素酶基因的3 ' UTR中有tRF-3靶位，可以歸一化為螢火蟲熒光素酶信號(hào)（圖4b）。只有未經(jīng)a4修飾的tRF-3b觸發(fā)了基因沉默，而m1a4修飾的tRF-3b則消除了這種基因沉默（圖4c-f）。對(duì)來自不同氨基酸群的四個(gè)不同的tRF-3b序列（tRNALeu的tRF-3009b， tRNAAla的tRF-3021b， tRNATyr的tRF-3030b和tRNAGln的tRF-3004b）觀察到這種效應(yīng)。
為了確保tRF的抑制不是過度表達(dá)的產(chǎn)物，作者還通過LNA（鎖定的核酸）敲低了內(nèi)源性tRF-3?？箃RF-3021特異性地抑制了tRF-3021報(bào)告因子的活性（圖4）。同樣，tRF-3009、tRF-3030和tRF-3004報(bào)告基因活性被相應(yīng)的LNAs去抑制（圖4h-j）。
總的來說，這表明由于種子退火到靶mRNA的問題，m1A減弱了tRF-3b的基因沉默。
圖4 m1A減弱了trf -3的基因沉默
5. TRMT6 / 61A依賴性m1A不降低tRF-3b的Argonaute相關(guān)性
由于tRF-3b上的m1A阻止了tRF-3b的沉默（圖4），作者測(cè)試了這種修飾是否降低了內(nèi)源性trf -3與Ago2的關(guān)聯(lián)。為此，作者創(chuàng)建了一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)flag - ha標(biāo)記的Ago2的細(xì)胞系（圖5a）。tgrt -seq在前100個(gè)與ago2相關(guān)的小RNA中鑒定出了trf -3（圖5b）。敲除TRMT6/61A后（圖5c），與m1A修飾相對(duì)應(yīng)的讀段錯(cuò)配百分比在與ago2相關(guān)的片段中（a）減少，但在與ago2相關(guān)的片段中（b）相對(duì)于輸入片段而言，沒有增加或減少（圖5d）。因此，TRMT6/61A對(duì)兩個(gè)片段中trf -3上的m1A的調(diào)節(jié)是相同的。m1A修飾不排除tRF-3b進(jìn)入與Argonaute的復(fù)合物。在敲除TRMT6/61A后，ago2相關(guān)部分中有幾種trf -3的少量（1-3倍）增加，但沒有超過FDR <0.05的閾值（圖5e）。相對(duì)于輸入部分，Ago相關(guān)部分中tRF-3水平?jīng)]有任何變化，這表明trmt6 /61依賴的m1A對(duì)tRF-3種子區(qū)域的修飾不會(huì)顯著影響Ago的直接結(jié)合。有趣的是，盡管在輸入和Ago結(jié)合的部分中，TRMT6/61A調(diào)節(jié)了總tRF-3b錯(cuò)配（m1A修飾）的百分比（圖5d）。綜合來看，m1A修飾的tRF-3s不會(huì)降低它們的Ago關(guān)聯(lián)，因此基因沉默的衰減很可能是因?yàn)榕c目標(biāo)mRNA的堿基配對(duì)減少（圖4）。
圖5 TRMT6 / 61A依賴性m1A不降低tRF-3b的Argonaute相關(guān)性
6. tRF-3b介導(dǎo)的m1a依賴性基因沉默變化
引導(dǎo)RNA 2-4位的堿基配對(duì)對(duì)于ago介導(dǎo)的基因沉默至關(guān)重要45。tRF-3b上的m1A特異性位于第4位（圖2和圖3）。由于m1A阻斷了典型的A:U堿基配對(duì)，作者假設(shè)，m1A在tRF-3種子區(qū)與靶RNA的堿基配對(duì)減弱，解釋了含有m1A的tRF-3中觀察到的基因沉默活性降低（圖4）。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者首先通過圖6a總結(jié)的策略確定了可能受m1A狀態(tài)調(diào)節(jié)的潛在tRF-3靶RNA。作者確定了頂部ago2相關(guān)的tRF-3b中的哪些種子（圖6b）也是TRMT6/61A敲除后m1A修飾減少最多的種子，以確定最有可能遭受生物學(xué)上顯著的靶標(biāo)預(yù)測(cè)干擾的種子（圖6c）。作者根據(jù)3 ' UTR中的互補(bǔ)性預(yù)測(cè)這些種子的靶標(biāo)。RNA-seq顯示，當(dāng)TRMT6/61A被敲除，tRF-3b在第4位被m1A低修飾時(shí)，這些種子的靶標(biāo)比非靶標(biāo)明顯受到抑制（圖6d）。
預(yù)測(cè)具有8-mer和7-mer匹配的靶標(biāo)比種子中與6-mer匹配的靶標(biāo)受到更顯著的抑制（圖6d， e）。在siTRMT6/61A之后，分別通過qPCR驗(yàn)證了最顯著抑制的8/7-mer tRF-3靶標(biāo)（TIMP3， CREB3L2， MBTPS1， CDK19， HIPK2， HERPUD1， RMND5A， ELMOD2和HLTF）的抑制（圖6f）。
為了證實(shí)這種基因抑制是由靶向3 ' UTR的tRF-3介導(dǎo)的，作者將具有單個(gè)進(jìn)化保守的tRF-3靶向8-mer位點(diǎn)的內(nèi)源性MBTPS1 3 ' UTR序列克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因中。MBTPS1 3 ' UTR報(bào)告基因確實(shí)被siTRMT6/61A抑制（圖6g）。另一個(gè)8-mer靶基因CREB3L2也得到了類似的結(jié)果（圖6g）。這兩個(gè)8-mer位點(diǎn)均由種子序列“TCAAATCT”預(yù)測(cè)，由tRNAGln中的tRF-3b代表（圖6b）。與預(yù)測(cè)一致，通過從tRNAGln中過表達(dá)未經(jīng)修飾的tRF-3004b可以模擬sitrmt依賴性抑制，而TRMT6/61A的表達(dá)不會(huì)減少（圖6h），而m1a修飾的tRF-3004b對(duì)3 ' UTR報(bào)告基因的抑制能力明顯較弱（圖6i）。綜上所述，tRF-3可以通過種子與目標(biāo)3 ' UTRs配對(duì)來調(diào)節(jié)基因的全局表達(dá)，而這一過程受到tRF-3種子區(qū)m1A修飾的干擾。
圖6 tRF-3b介導(dǎo)的m1a依賴性基因沉默變化
7. 膀胱癌中trf - 3m1a水平及tRF-3靶點(diǎn)的改變
據(jù)報(bào)道，一些tRNA修飾酶，包括TRMT6/61A，在幾種癌癥類型中顯著上調(diào)47。TRMT6上調(diào)在膀胱尿路上皮癌（BLCA）中是顯著的（圖7a）。最重要的是，通過western blotting檢測(cè)到腫瘤樣品中TRMT6和TRMT61A蛋白水平的顯著上調(diào)（圖7b， c）。
TRMT6表達(dá)水平與tRF-3b整體m1A錯(cuò)配水平呈正相關(guān)，并且在BLCA腫瘤樣本中m1A錯(cuò)配顯著增加，這與TRMT6/ 61a較高的表達(dá)水平一致（圖7d， e）。與較高水平的干擾m1A修飾相一致，在作者的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，與正常相比，通過種子-mer匹配預(yù)測(cè)的tRF-3b靶RNA在BLCA腫瘤樣本中比非靶點(diǎn)上調(diào)（圖7f）。組合種子和補(bǔ)充圖7e:單個(gè)種子）。此外，在TCGA BLCA數(shù)據(jù)中，TRMT6水平高的腫瘤誘導(dǎo)了tRF-3b靶點(diǎn)（圖7g）。有趣的是，在被siTRMT6/61A抑制的9個(gè)trmt3靶點(diǎn)中，有8個(gè)（圖6e）在TCGA膀胱患者樣本中與TRMT6的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（圖7h）。綜上所述，這些結(jié)果表明TRMT6/61A調(diào)節(jié)腫瘤中tRF-3上的m1A水平，并且BLCA中TRMT6/61A的升高與腫瘤中tRF-3靶點(diǎn)的預(yù)期誘導(dǎo)有關(guān)。
圖7膀胱癌中trf - 3m1a水平及tRF-3靶點(diǎn)的改變
8. TRMT6/61A修飾tRF-3b對(duì)于維持未折疊蛋白的反應(yīng)至關(guān)重要
為了探索m1a依賴性tRF-3靶點(diǎn)的潛在生物學(xué)功能，作者通過RNA-seq數(shù)據(jù)的基因集富集分析，重點(diǎn)研究了siTRMT6/61A顯著下調(diào)和高trmt6腫瘤樣本中顯著上調(diào)的生物學(xué)途徑。針對(duì)1532個(gè)Reactome通路的富集分析在細(xì)胞系和患者數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)重疊通路。其中一種途徑是未折疊蛋白反應(yīng)或UPR（圖8a， b）。
m1a依賴的tRF-3靶點(diǎn)，特別是MBTPS1（也稱為1位點(diǎn)蛋白酶或S1P）和CREB3L2，先前與UPR和蛋白質(zhì)分泌有關(guān)48，49，這表明TRMT6/61A可能通過去抑制這些tRF-3靶點(diǎn)來幫助維持生長(zhǎng)細(xì)胞中的UPR。MBTPS1 （S1P）因其切割和激活高爾基體上不同蛋白質(zhì)底物的作用而聞名，包括轉(zhuǎn)錄因子ATF6和creb3l250，51，52。為了直接測(cè)試TRMT6/61A是否在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下調(diào)節(jié)UPR，作者使用了一個(gè)由最小啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告子，該啟動(dòng)子帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件2 （ERSE2），可被ATF6轉(zhuǎn)錄因子53激活。報(bào)告顯示，正如預(yù)期的那樣，熒光素酶活性增加依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應(yīng)元件和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（tunicamycin， Tm）。在HEK293T和T24膀胱癌細(xì)胞系中，TRMT6/61A敲低可顯著抑制UPR誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)（圖8c）。轉(zhuǎn)染未修飾的tRF-3004b，而不轉(zhuǎn)染m1A修飾的tRF-3004b，相對(duì)于NT1和NT2非靶向RNA，可以降低UPR報(bào)告基因的活性（圖8d），這表明tRF-3b上的m1A狀態(tài)可以直接調(diào)節(jié)未折疊蛋白的反應(yīng)。為了確保內(nèi)源性tRF-3004b抑制參與UPR的靶基因，作者通過LNA敲低了內(nèi)源性tRF-3004b，這在ER應(yīng)激后顯著增加了靶細(xì)胞基因CREB3L2、HERPUD1、MBTPS1和HLTF的水平（圖8e、f）?？傊@表明trmt6 / 61a介導(dǎo)的trf -3上的m1A修飾對(duì)維持UPR穩(wěn)態(tài)很重要。
圖8 TRMT6/61A修飾tRF-3b對(duì)于維持未折疊蛋白的反應(yīng)至關(guān)重要
結(jié)論
最后，快速增殖的癌細(xì)胞通過激活促存活UPR來維持蛋白穩(wěn)態(tài)以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此，UPR與癌癥特征的許多方面密切相關(guān)，并已成為有希望的治療靶點(diǎn)。先前已經(jīng)注意到，在包括膀胱癌在內(nèi)的幾種癌癥類型中，uprr相關(guān)基因在全球范圍內(nèi)上調(diào)68。在這里，作者發(fā)現(xiàn)TRMT6/61A最可能通過修飾tRF-3來促進(jìn)UPR，并去抑制tRF-3在UPR通路的ATF6分支中的靶點(diǎn)MBTPS1和CREB3L2。有趣的是，MBTPS1和CREB3L2可以被tRNAGln中的tRF-3004b靶向，tRNAGln是一種被發(fā)現(xiàn)在酵母中調(diào)節(jié)UPR的tRNA 69。當(dāng)然，作者不排除TRMT6/61A通過修飾tRNA和mRNA對(duì)UPR產(chǎn)生額外影響的可能性。作者如何利用本文描述的機(jī)制使腫瘤細(xì)胞對(duì)促凋亡UPR敏感將是未來另一個(gè)有趣的研究課題。
實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)，RNA凈化，合成m1A RNA寡核苷酸，RIP免疫沉淀反應(yīng)，小RNA-seq文庫(kù)制備，小RNA-seq圖譜和錯(cuò)配分析，敲低TRMT6/61 A，Northern blot，雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)，鎖定核酸（LNA）敲除內(nèi)源性tRF，RT-qPCR，RNA-seq文庫(kù)的制備和分析，蛋白提取和Western Blot，未折疊蛋白反應(yīng)報(bào)告試驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)：
Su Z, Monshaugen I, Wilson B, Wang F, Klungland A, Ougland R, Dutta A. TRMT6/61A-dependent base methylation of tRNA-derived fragments regulates gene-silencing activity and the unfolded protein response in bladder cancer. Nat Commun. 2022 Apr 20;13(1):2165. doi: 10.1038/s41467-022-29790-8. PMID: 35444240; PMCID: PMC9021294.