乳酸化修飾介導(dǎo)飲食限制的長壽秘訣

       眾所周知，飲食限制（DR）能促進(jìn)自噬，從而發(fā)揮其長壽效應(yīng)。雖然SAMS-1（S-腺苷蛋氨酸合成酶-1）已被證明是DR反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，但人們對S-腺苷蛋氨酸（SAM）和 SAM 依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶在自噬和 DR 誘導(dǎo)的長壽中的作用知之甚少。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn) DR 和 SAMS-1 通過限制 SAM 的供應(yīng)，抑制了組蛋白 H3K4 甲基轉(zhuǎn)移酶 SET-2 的活性。因此，降低的 H3K4me3 水平促進(jìn)了兩種轉(zhuǎn)錄因子 HLH-30/TFEB 和 PHA-4/FOXA 的表達(dá)和活性，這兩種轉(zhuǎn)錄因子都能調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。然后我們發(fā)現(xiàn)，HLH-30/TFEB 和 PHA-4/FOXA 在它們共同的靶基因上協(xié)同作用，介導(dǎo)了自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而延長了動物的壽命。因此，我們的研究表明，SAMS-1-SET-2軸是一個營養(yǎng)傳感模塊，可從表觀遺傳學(xué)角度協(xié)調(diào)HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而控制大自噬/自噬和對DR的長壽反應(yīng)。
       本文于2023年1月發(fā)表在《Autophagy》IF: 13.3期刊上。
技術(shù)路線

實驗結(jié)果
1、自噬激活是sams-1突變體長壽的必要條件
       為了解sams-1是否控制自噬以調(diào)節(jié)衰老速度，首先使用表達(dá)GFP標(biāo)記的LGG-1，Atg8/LC3的同源物，來監(jiān)測自噬。作者發(fā)現(xiàn)，在sams-1(ok2946)突變體的不同組織中，GFP::LGG-1自噬小體的數(shù)量都有所增加，包括下胚層接縫細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、咽球和腸細(xì)胞（圖1A）。還發(fā)現(xiàn)與對照組相比，sams-1 RNAi顯著增加了自噬通量（圖1B）。接下來探究自噬相關(guān)基因是否是sams-1突變體長壽的必要條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一些自噬相關(guān)基因，如bec-1、vps-34或lgg-1/lgg-2/Atg8的敲除抑制了sams-1(ok2946)突變體的壽命（圖1c）?？傊@些結(jié)果表明，sams-1失活可刺激自噬，從而促進(jìn)長壽。

圖1自噬激活是sams-1突變體長壽的必要條件

2、HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA介導(dǎo)sams-1突變體的自噬和壽命
       通過文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA與自噬相關(guān)。本文發(fā)現(xiàn)當(dāng)sams-1基因敲除時，HLH-30和PHA-4的蛋白和mRNA表達(dá)均上調(diào)（圖2a-c），表明sams-1 可能調(diào)控hlh-30和pha-4的轉(zhuǎn)錄。此外，通過測量HLH-30的核與細(xì)胞質(zhì)比率，發(fā)現(xiàn)在sams-1基因敲除突變體中，HLH-30的核易位增強(qiáng)（圖2d）。與此相一致的是，在sams-1（ok2946）突變體中，一些自噬相關(guān)基因，包括lgg-1、lgg-2、sqst-1/p62、atg-4.1、atg-11、epg-3、epg-5、allo-1和vps-34的表達(dá)水平都有所增加（圖2c）。
       此外，作者發(fā)現(xiàn)，SAM補(bǔ)充顯著廢除了HLH-30的核易位（圖2D）。為研究在sams-1突變體中觀察到的自噬活性和壽命的增加是否需要HLH-30或PHA-4的活性，首先評估hlh-30或pha-4 RNAi對自噬活性的影響。發(fā)現(xiàn)hlh-30或pha-4的敲除顯著抑制sams-1（ok2946）突變體自噬通量的增加，其次也抑制了eat-2（-）DR動物自噬通量的增加（圖2e、f）。敲除hlh-30或pha-4完全抑制了sams-1（ok2946）突變體壽命的延長（圖2g，h），表明HLH-30或PHA-4的活性對sams-1（ok2946）突變體壽命的延長至關(guān)重要。綜上所述，sams-1可能調(diào)節(jié)HLH-30和PHA-4的表達(dá)和活性，從而介導(dǎo)自噬和壽命。

圖2 HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA介導(dǎo)sams-1突變體的自噬和壽命

3、SET-2是一種H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶，通過HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA調(diào)節(jié)自噬
       由于補(bǔ)充SAM可完全消除sams-1突變體中的HLH-30核易位表型，作者推測SAMS-1的下游有一個或多個甲基轉(zhuǎn)移酶在調(diào)節(jié)HLH-30的活性。因此，以HLH-30核易位為讀數(shù)，進(jìn)行了小規(guī)模的蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶RNAi篩選。set-2的無效突變也顯著增加了HLH-30的核易位（圖3a）。值得注意的是，在sams-1（ok2946）無效突變體中，HLH-30核質(zhì)比高于set-2（bn129）無效突變體（圖3a），這表明在sams-1突變體中HLH-30核易位的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于set-2突變體。因此，其他基因也可能在sams-1的下游發(fā)揮作用，與set-2平行調(diào)節(jié)HLH-30的核易位。
       與sams-1基因缺失類似，set-2 基因缺失也增加HLH-30和PHA-4的mRNA和蛋白表達(dá)（圖3b-d）。此外，發(fā)現(xiàn)在set-2（ok952）突變體的下胚層縫細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、咽球和腸細(xì)胞中，GFP::LGG-1點(diǎn)的數(shù)量增加，這表明set-2（ok952）突變體的自噬活性增強(qiáng)（圖3e）。在表達(dá)gfp::lgg-1::mcherry::lgg-1ΔG的set-2（bn129）突變體中，GFP:mCherry信號比降低，這也表明自噬通量增加（圖3f）。此外，作者發(fā)現(xiàn)自噬通量的增加需要HLH-30和PHA-4的活性（圖3g）?？傊?，這些結(jié)果表明SET-2通過HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA調(diào)節(jié)自噬。

圖3 SET-2是一種H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶，通過HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA調(diào)節(jié)自噬

4、SET-2在DR通路中起作用，需要自噬相關(guān)基因來促進(jìn)壽命
       為進(jìn)一步了解SET-2在DR誘導(dǎo)的長壽中的作用，作者進(jìn)行了各種遺傳顯性分析，以探究set-2與sams-1和DR在壽命調(diào)控中的遺傳關(guān)系。首先創(chuàng)建了set-2過表達(dá)株系，提高了全局H3K4me3水平，改善了set-2（bn129）突變體的長壽表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，set-2過表達(dá)能改善sams-1突變體的壽命表型（圖4a），這表明set-2在壽命調(diào)控中作用于sams-1的下游。過表達(dá)set-2會縮短eat-2(ad1116)突變體的壽命（圖4b）。總之set-2在調(diào)控DR誘導(dǎo)的長壽過程中作用于sams-1 的下游。
       接著詢問自噬相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和基因是否也是延長set-2突變體壽命所必需的，正如在sams-1突變體（圖1c，圖2g，h）和eat-2突變體中所觀察到的那樣。敲除轉(zhuǎn)錄因子hlh-30或pha-4（圖4c、d）或自噬相關(guān)基因bec-1、vps-34或lgg-1/lgg-2完全抑制了set-2（ok952）突變體壽命的延長（圖4e、f）。綜上所述，SET-2甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低會激活HLH-30和PHA-4，從而介導(dǎo)DR誘導(dǎo)的長壽。

圖4 SET-2在DR通路中起作用，需要自噬相關(guān)基因來促進(jìn)壽命

5、AMX-1 H3K4去甲基化酶在調(diào)控HLH-30/TFEB中拮抗SET-2
       接下來研究amx-1耗竭對SAMS-1/SET-2介導(dǎo)的HLH-30活化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，amx-1 RNAi抑制了sams-1 RNAi誘導(dǎo)的HLH-30核易位（圖5a）。amx-1 RNAi還抑制了eat-2(ad1116)和set-2(bn129)動物的HLH-30核易位（圖5b）。amx-1的RNAi敲除也降低了eat-2和set-2突變體中hlh-30的mRNA和蛋白表達(dá)（圖5c）。此外，amx-1 RNAi抑制了sams-1 RNAi誘導(dǎo)的自噬通量激活，這表明amx-1調(diào)控自噬激活（圖5d）。通過遺傳顯性分析，發(fā)現(xiàn)敲除amx-1能顯著縮短sams-1（ok2946）、set-2（ok952）和eat-2（ad1116）突變體的壽命（圖5e-g）。綜上所述，amx-1能拮抗set-2對自噬和壽命的調(diào)控作用。

圖5 AMX-1 H3K4去甲基化酶在調(diào)控HLH-30/TFEB中拮抗SET-2

6、SET-2和AMX-1調(diào)節(jié)H3K4me3水平，控制HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA的表達(dá)
       由于SET-2和AMX-1控制組蛋白H3K4三甲基化的動態(tài)變化，因此假設(shè)HLH-30和PHA-4的表達(dá)受hlh-30和pha-4啟動子區(qū)H3K4三甲基化狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在sams-1(ok2946)和eat-2(ad1116)突變體中，全局H3K4me3水平明顯下降（圖6a）。
       然后，通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗研究set-2和sams-1突變體中hlh-30啟動子的H3K4me3水平。發(fā)現(xiàn)，在set-2（bn129）和sams-1（ok2946）突變體中，hlh-30啟動子的H3K4me3水平顯著降低（圖6b）。HLH-30與自身啟動子結(jié)合的增加表明啟動子活性增加。在sams-1（ok2946）和set-2（bn129）突變體中，HLH-30在其啟動子上的招募都有所增加（圖6c）。因此，在sams-1和set-2突變體中，低H3K4me3水平和HLH-30與hlh-30啟動子結(jié)合的增加可能與這些動物中hlh-30轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)相對應(yīng)。
       DR增加pha-4的表達(dá)，但這種誘導(dǎo)的基本機(jī)制完全未知。作者假設(shè)，與hlh-30相似，pha-4的表達(dá)也受H3K4me3水平變化的控制。在這里，作者發(fā)現(xiàn)與WT N2相比，sams-1（ok2946）和set-2（bn129）突變體中pha-4啟動子的H3K4me3 水平也有所下降（圖6d），這表明饑餓過程中hlh-30和pha-4的誘導(dǎo)都是組蛋白標(biāo)記變化的結(jié)果。同樣，在amx-1突變體中，hlh-30和pha-4啟動子的H3K4me3水平也有所增加（圖6e，f）。綜上所述，DR可能通過SAMS-1和SET-2調(diào)節(jié)H3K4me3的動態(tài)，從而控制hlh-30和pha-4的表達(dá)，進(jìn)而控制自噬和壽命。

圖6 SET-2和AMX-1調(diào)節(jié)H3K4me3水平，控制HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA的表達(dá)

7、HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA協(xié)同調(diào)節(jié)自噬和壽命
       作者猜測HLH-30和PHA-4也可能共同占據(jù)自噬相關(guān)基因的啟動子，并對其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行核心調(diào)節(jié)。為驗證這一假設(shè)，分析了modENCODE項目（ftp://data.modencode.org/）中的HLH-30和PHA-4 ChIP測序數(shù)據(jù)集。對結(jié)合位點(diǎn)分布的分析表明，HLH-30和PHA-4結(jié)合位點(diǎn)富集在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游約50 bp的范圍內(nèi)（圖7a）。51%的HLH-30結(jié)合位點(diǎn)與PHA-4結(jié)合位點(diǎn)重疊，而38%的PHA-4結(jié)合位點(diǎn)與HLH-30結(jié)合位點(diǎn)重疊（圖7b）。有886個基因的啟動子區(qū)域同時包含HLH-30和PHA-4結(jié)合位點(diǎn)（圖7b）。值得注意的是，這些數(shù)據(jù)集來自喂養(yǎng)的蠕蟲，表明在非刺激條件下，這兩種轉(zhuǎn)錄因子與共同靶基因的結(jié)合存在基礎(chǔ)水平。
       然后，比較HLH-30和PHA-4的峰值中心之間的距離。距離分布顯示，它們的峰值中心之間的距離大多為~100 bp，表明這兩個轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的存在位置很近（圖7c）。這些數(shù)據(jù)表明，這兩個轉(zhuǎn)錄因子可能共同占據(jù)了相同的啟動子區(qū)域，或者至少結(jié)合到了附近的位點(diǎn)，從而合作調(diào)控它們共同靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄。
       然后，進(jìn)行GO富集分析，以確定這886個共同靶基因的功能注釋。發(fā)現(xiàn)"自噬"和"衰老"在其中占了很大比例（圖7d）。與ChIP-seq分析一致，在非刺激條件下，HLH-30和PHA-4都與lgg-1啟動子結(jié)合（圖7e，f）。在sams-1（ok2946）和set-2（bn129）突變體中，這兩種轉(zhuǎn)錄因子在lgg-1啟動子上的結(jié)合都有所增加，這可能導(dǎo)致了lgg-1的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。
       有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)HLH-30在lgg-1和sodh-1啟動子區(qū)域的結(jié)合不受RNAi 敲除pha-4的影響，而PHA-4在lgg-1和sodh-1啟動子區(qū)域的結(jié)合也不受RNAi 敲除hlh-30的影響（圖7g，h）。因此，綜合來看，HLH-30和PHA-4可能獨(dú)立地結(jié)合到它們共同靶標(biāo)啟動子區(qū)域的相鄰位點(diǎn)，而不是共同占據(jù)相同的位點(diǎn)，從而協(xié)同控制它們的轉(zhuǎn)錄。

圖7 HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA協(xié)同調(diào)節(jié)自噬和壽命

       總而言之，本文揭示，通過SAMS-1/SET-2軸、H3K4甲基化和HLH-30/PHA-4模塊協(xié)同調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，提出飲食限制介導(dǎo)的長壽模型。在自由飲食條件下，SAMS-1合成SAM，SAM是SET-2進(jìn)行組蛋白H3K4甲基化的底物。hlh-30和pha-4的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平提供了基礎(chǔ)的自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在DR條件下，sams-1水平降低，因此SET-2催化的H3K4甲基化所需的SAM減少。AMX-1的活性超過了SET-2的活性。因此，H3K4me3在hlh-30和pha-4啟動子上的低甲基化增強(qiáng)了它們的轉(zhuǎn)錄，這反過來又導(dǎo)致自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄增加，從而激活自噬并延長壽命。

圖8通過SAM依賴性甲基化實現(xiàn)自噬和長壽的模型。

實驗方法
C. elegans strains的培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建，壽命分析實驗，核定位實驗，GFP::LGG-1熒光標(biāo)記自噬，WB，RT-qPCR，ChIP
參考文獻(xiàn)
Lim CY, Lin HT, Kumsta C, Lu TC, Wang FY, Kang YH, Hansen M, Ching TT, Hsu AL. SAMS-1 coordinates HLH-30/TFEB and PHA-4/FOXA activities through histone methylation to mediate dietary restriction-induced autophagy and longevity. Autophagy. 2023 Jan;19(1):224-240. doi: 10.1080/15548627.2022.2068267. Epub 2022 May 3. PMID: 35503435; PMCID: PMC9809948.