前列腺癌中UBC9缺乏增強免疫刺激巨噬細胞激活和抗腫瘤T細胞反應

       前列腺癌(PCa)的進展受腫瘤微環(huán)境(TME)中存在的多種細胞類型的調(diào)控，CD8+T細胞是主要的殺瘤效應細胞群，通常存在于腫瘤反應性基質(zhì)中，并不斷被周圍的共抑制信號滅活。前列腺癌并不容易對ICB治療有反應,這歸因于腫瘤浸潤性CD8+T細胞的激活不足及腫瘤相關(guān)巨噬細胞的作用。作者的數(shù)據(jù)證明了UBC9介導的STAT4 summoylation在TAM相關(guān)的免疫抑制中起著至關(guān)重要的作用，并為PCa治療的免疫療法的發(fā)展提供了重要的前景。本文于2023年2月發(fā)布于《Journal of Clinical Investigation》,IF=15.9。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1、UBC9表達與巨噬細胞激活缺陷和前列腺癌預后不良有關(guān)
       為了研究SUMOylation在PCa中的臨床相關(guān)性，作者關(guān)注了最關(guān)鍵的SUMO E2偶聯(lián)酶UBC9，并查詢了一系列PCa患者的表達和生存數(shù)據(jù)集。作者比較了前列腺癌與正常組織、不同腫瘤分期和病理分級之間UBC9的表達水平。值得注意的是，UBC9在PCa中的表達明顯更高(圖1A)，并且與晚期(圖1B)和更高的Gleason評分(圖1C)相關(guān)。接下來，作者進行了生存分析，觀察到較高的UBC9轉(zhuǎn)錄水平與較差的生化無復發(fā)生存(圖1D)和無轉(zhuǎn)移生存(圖1E)相關(guān)。此外，作者內(nèi)部前列腺腫瘤和正常組織樣本qPCR和Western blotting證實，與鄰近正常前列腺部位相比，UBC9在腫瘤組織中表達上調(diào)(圖1、F和G)。綜上所述，這些結(jié)果表明，UBC9高表達的PCa患者比UBC9低表達的PCa患者預后更差。上述結(jié)果促使作者評估UBC9對前列腺腫瘤組織中不同免疫亞群的潛在貢獻。通過CIBERSORT分析發(fā)現(xiàn)，在UBC9hiPCa樣本中，經(jīng)典活化的巨噬細胞(M1)是免疫細胞類型下降最明顯的，而調(diào)節(jié)性T細胞是免疫細胞類型增加最顯著的(圖1H)。之前，作者證明了UBC9介導的SUMOylation通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化影響調(diào)節(jié)性T細胞的誘導。因此，作者假設(shè)TAM在針對腫瘤細胞的先天免疫設(shè)置中起關(guān)鍵作用。作者接下來分析了UBC9hi和UBC9lo集群之間的差異表達基因(DEGs)，并表征了與“抗原呈遞(MHC I相關(guān))”、“先天免疫”和“T細胞活化”相關(guān)的基因呈負相關(guān);在UBC9hi前列腺癌患者中，與“腫瘤進展”和“免疫檢查點”呈正相關(guān)(圖1I)。接下來，作者進行了基因集富集分析，發(fā)現(xiàn)在UBC9hiPCa受試者中，與癌組織中“破骨細胞分化”、“TNF信號通路”、“JAK-STAT信號通路”和“PD-1和PD-L1檢查點”相關(guān)的基因富集(圖1J)。最后，作者通過染色UBC9和人巨噬細胞標志物CD68進行免疫熒光檢測。UBC9在PCa中高表達，尤其是在TAM中(圖1K)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了UBC9表達與TAM激活之間的關(guān)聯(lián)，這與其抗原呈遞能力有關(guān)。

圖1. UBC9表達與巨噬細胞激活缺陷和前列腺癌預后不良有關(guān)

2、抑制UBC9可阻止PCa的進展
       為了檢驗UBC9是否在體內(nèi)介導PCa腫瘤生長，作者用UBC9抑制劑2-D08 (10 mg/kg，每3天，瘤內(nèi)注射)或DMSO作為對照治療RM-1荷瘤C57BL/6J小鼠(圖2A)。TUNEL染色顯示，注射2-D08明顯抑制腫瘤生長(圖2B)，減少腫瘤質(zhì)量(圖2、C和D)。具體而言，2-D08處理組和對照組TAM浸潤頻率無顯著差異(圖2E)，但CD86+巨噬細胞頻率更高(圖2F)， 2-D08處理組TAM中MHC I表達升高(圖2G)。此外，2-D08處理導致更高比例的CD8+T細胞浸潤(圖2H)。有趣的是，作者還注意到，在2-D08處理組中，PD-1+CD8+T細胞顯著增加(圖2J)，這可能是繼發(fā)于T細胞激活狀態(tài)的增強。鑒于前列腺腫瘤細胞也表達UBC9，作者下一步試圖檢查2-D08對前列腺腫瘤生長可能的直接影響。為此，作者首先分別用2-D08和TAK-981(一種選擇性和有效的sumo激活酶E1的小分子抑制劑)治療腫瘤細胞生長情況。綜上所述，這些數(shù)據(jù)支持UBC9抑制劑不僅通過促進TAM和CD8+T細胞的活化，而且通過直接抑制腫瘤細胞的生長來阻礙PCa的進展。

圖2.抑制UBC9可抑制PCa的進展

3、巨噬細胞中UBC9缺乏抑制PCa的進展
       為了進一步確定TAM在UBC9介導的PCa進展中的作用，作者構(gòu)建了攜帶前列腺腫瘤的LyzM-Cre-UBC9-loxP巨噬細胞條件敲除小鼠模型(圖3A)。作者發(fā)現(xiàn)UBC9-/-小鼠植入的前列腺腫瘤生長速度要慢得多(圖3B)，體積要小得多(圖3C和D)。然而，兩組間浸潤性TAM未見差異(圖3E)。相比之下，UBC9-/-小鼠中CD86+ TAM的比例(圖3F)和TAM中MHC I的表達水平(圖3G)明顯更高。重要的是，UBC9-/-小鼠表現(xiàn)出相似比例的腫瘤浸潤CD4+ T細胞，但腫瘤內(nèi)CD8+T細胞比例明顯更高(圖3H)。與這些觀察結(jié)果一致，從UBC9-/-小鼠分離的腫瘤中IFN-γ+CD8+T細胞的百分比增加(圖3I)，并且在UBC9-/-小鼠腫瘤中也觀察到更高比例的表達pd-1的CD8+T細胞(圖3J)。通過免疫熒光染色，作者發(fā)現(xiàn)TAM與腫瘤浸潤性CD8+T細胞非常接近(圖3K)，表明它們之間存在密切的相互作用。綜上所述，這些結(jié)果表明巨噬細胞中UBC9的缺乏通過動員抗腫瘤CD8+T細胞顯著減緩了PCa的進展文。

圖3.巨噬細胞中UBC9缺乏抑制PCa的進展

4、UBC9缺失可增強巨噬細胞M1程序
       (M1)巨噬細胞的經(jīng)典活化導致促炎細胞因子和表面共刺激分子的上調(diào)，這是最佳抗腫瘤反應所必需的。通過實時qPCR檢測，用2-D08預處理LPS刺激的骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)可誘導CD86、MHC I和促炎細胞因子如IFN-γ和TNF-α的高表達(圖4A)。流式細胞術(shù)分析CD86、MHC I(圖4B)、IFN-γ和TNF-α(圖4C)顯示它們在2-D08處理的BMDMs中相對豐富，ELISA檢測相應培養(yǎng)上清中也檢測到較高濃度的IFN-γ和TNF-α(圖4D)。為了進一步證實上述發(fā)現(xiàn)，作者比較了M1條件下分化的WT和UBC9缺陷BMDMs的激活標記。同樣，通過實時qPCR(圖4E)、流式細胞術(shù)(圖4、F和G)和ELISA分析(圖4H)，在UBC9-/-BMDMs中，CD86、MHC I和促炎細胞因子(IFN-γ和TNF-α)的表達也明顯增強?？傊?，作者的數(shù)據(jù)支持UBC9缺陷促進與抗腫瘤反應相關(guān)的巨噬細胞M1程序。

圖4.UBC9的缺失促進巨噬細胞的激活

5、缺乏UBC9的巨噬細胞能激活抗原特異性CD8+T細胞
       為了確定UBC9對巨噬細胞激活效應CD8+T細胞功能的影響，作者使用了B16-OVA黑素瘤小鼠。簡單地說，在第3天和第10天，將LPS和OVA脈沖的WT和UBC9-/-巨噬細胞在B16-OVA腫瘤附近進行皮內(nèi)轉(zhuǎn)移(圖5A)。與上述結(jié)果相似，UBC9-/-巨噬細胞轉(zhuǎn)移的腫瘤表現(xiàn)為生長速度減慢(圖5B)，體積變小(圖5、C和D)。有趣的是，兩組小鼠的TAM比例沒有明顯差異(圖5E)。然而，在UBC9-/-巨噬細胞中，CD86+TAM的比例更高(圖5F)， MHC I的表達也更高(圖5G)。瘤內(nèi)CD4+ T細胞的比例相當，但在UBC9-/-組中檢測到瘤內(nèi)CD8+T細胞的比例要高得多(圖5H)，其特征是IFN-γ(圖5I)和PD-1(圖5J)表達增強。這些數(shù)據(jù)表明，UBC9-/-巨噬細胞在激活腫瘤浸潤性CD8+T細胞方面更有效。為了進一步證實上述觀察結(jié)果，作者將WT或UBC9缺陷的ova脈沖巨噬細胞與OT-I CD8+T細胞共培養(yǎng)。正如預期的那樣，與WT對照組相比，UBC9-/-巨噬細胞顯著增強了CD8+T細胞中Ki67(圖5K)、顆粒酶B(圖5L)和IFN-γ(圖5M)的表達。為了排除腫瘤細胞直接抑制CD8+T細胞介導的免疫監(jiān)視的可能性，作者在存在或不存在UBC9抑制劑2-D08的情況下處理B16-OVA細胞，然后與OT-I CD8+ T細胞共培養(yǎng)?？偟膩碚f，作者的數(shù)據(jù)表明，UBC9的缺失促進巨噬細胞M1程序，同時增強抗原遞呈能力，從而誘導CD8+T細胞活化。

圖5.巨噬細胞中UBC9的缺失激活抗原特異性CD8+ T細胞

6、UBC9介導的STAT4 summoylation抑制巨噬細胞M1程序
       為了進一步探索UBC9抑制巨噬細胞M1程序的機制，作者對WT和UBC9-/-前列腺荷瘤小鼠的TAM進行了轉(zhuǎn)錄組學分析。基因本體(GO)分析發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT信號通路是UBC9-/-TAM中被上調(diào)的DEGs富集的最突出的信號通路(圖6,A和B)。由于STAT4是巨噬細胞中介導IL-12依賴性IFN-γ產(chǎn)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，因此作者檢查了UBC9是否在IL-12刺激后介導STAT4 summoylation。用BSA或IL-12刺激BMDMs，然后用STAT4抗體進行免疫沉淀，所得產(chǎn)物用SUMO1抗體探測。在IL-12刺激的BMDMs中更明顯地檢測到分子量為STAT4+ SUMO1的反應帶(圖6C)。此外，STAT4的summoylation在異位UBC9表達的BMDMs中得到進一步證實(圖6D)。接下來，攜帶FLAG標記的Stat4-WT和Stat4-K350R(350位賴氨酸殘基被精氨酸取代)的腺病毒被轉(zhuǎn)導到BMDMs中，隨后進行IL-12刺激，然后使用FLAG抗體進行免疫沉淀。正如預期的那樣，一旦賴氨酸350突變，SUMO1活性帶就消失了(圖6E)。為了檢查SUMOylation對STAT4的功能影響，收集上述轉(zhuǎn)導的BMDMs，在IL-12刺激后，使用FLAG抗體分析STAT4的異位亞細胞定位。通過免疫印跡和免疫熒光染色，在STAT4 - k350r轉(zhuǎn)導的細胞中檢測到明顯更高的異位STAT4核比例(圖6、F和G)，表明SUMOylation抑制STAT4核易位。為了進一步檢查SUMOylation是否會影響STAT4的穩(wěn)定性，作者將上述轉(zhuǎn)導的BMDMs用環(huán)己亞胺處理以阻斷蛋白質(zhì)合成，然后分析異位STAT4水平。在STAT4 - k350r轉(zhuǎn)導的細胞中檢測到更高水平的異位STAT4(圖6H)，這促使作者檢查其泛素化狀態(tài)。為此，用MG-132(一種蛋白酶體抑制劑)處理細胞。事實上，SUMOylation顯著提高了STAT4的泛素化水平(圖6I)，這促進了蛋白酶體依賴的降解機制。與這些觀察結(jié)果一致，STAT4- k350r轉(zhuǎn)導的細胞在mRNA和蛋白水平上均表現(xiàn)出更高的IFN-γ和TNF-α表達(圖6,J和K)。為了確定STAT4 summoylation對巨噬細胞抗腫瘤發(fā)展的功能影響，首先在3'-非翻譯區(qū)轉(zhuǎn)染STAT4 siRNA以敲低內(nèi)源性STAT4，然后用STAT4 - wt或STAT4 - k350r腺病毒轉(zhuǎn)導BMDMs，然后與CD8+T細胞共培養(yǎng)。在stat4k350r轉(zhuǎn)導的BMDMs培養(yǎng)中，CD8+T細胞的增殖和活化明顯增加(圖6L)。為了證實這一觀察結(jié)果，作者采用了將Stat4-K350R或stat4 - wt轉(zhuǎn)導的巨噬細胞轉(zhuǎn)移到前列腺腫瘤的鄰近部位?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)支持STAT4在賴氨酸350處的SUMOylation抑制STAT4的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。

圖6.UBC9介導的STAT4 SUMOylation抑制巨噬細胞活化

7、抑制UBC9與抗PD-1治療協(xié)同抑制前列腺腫瘤生長
        最后，作者試圖將上述發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床環(huán)境。作者首先檢查了CD8+T細胞耗竭對腫瘤生長的影響。CD8+T細胞的缺失導致腫瘤生長最快，幾乎消除了巨噬細胞特異性UBC9缺陷的治療效果(圖7,A-C)，這進一步支持了TAM的抗腫瘤作用主要是由于CD8+T細胞的啟動的觀點。鑒于UBC9-/- TAM上調(diào)CD8+T細胞上PD-1的表達，作者假設(shè)UBC9抑制劑與抗PD-1治療協(xié)同抑制PCa。為此，在PCa模型中評估了聯(lián)合治療(2-D08加抗PD-1)與單一治療(2-D08或單獨抗PD-1)的治療效果(圖7D)。值得注意的是，2-D08聯(lián)合抗PD-1抑制前列腺腫瘤進展的效果遠高于單獨使用2-D08或抗PD-1 (圖7,E-G)。在2-D08聯(lián)合抗PD-1治療后，前列腺腫瘤中CD8+T細胞頻率(圖7H)的增加更為明顯，CD8+T細胞中IFN-γ+ T細胞的比例也更高(圖7I)。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，UBC9抑制劑聯(lián)合PD-1阻斷抗體可能是臨床治療前列腺癌的可行策略。

圖7.抑制UBC9與抗pd -1治療協(xié)同抑制前列腺腫瘤生長

結(jié)論
       綜上所述，缺乏UBC9的巨噬細胞表現(xiàn)出STAT4表達和轉(zhuǎn)錄活性的增強，這有利于TAM M1極化和CD8+效應T細胞的激活。鑒于腫瘤中SUMOylation過程的抑制會對其他TME組分產(chǎn)生全球性的影響，作者不能排除UBC9的化學阻斷除了TAM和腫瘤細胞之外還存在其他機制的可能性。盡管如此，作者的重點是解決與CD8+效應T細胞激活相關(guān)的UBC9對巨噬細胞極化的影響。在這種情況下，作者提供了分子和細胞對TAM腫瘤活性操縱的見解，并提出了重塑抗腫瘤TME的有價值的方法?？偟膩碚f，作者的數(shù)據(jù)支持使用UBC9抑制劑和PD-1阻斷劑可能是臨床治療PCa的可行方法。

實驗方法
轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建、生信分析、細胞培養(yǎng)、異種移植腫瘤模型、流式細胞術(shù)、RNA提取、qPCR、WB、共聚焦顯微鏡分析、腫瘤浸潤白細胞的分離、細胞活力分析、ELISA、體外SUMO化蛋白翻譯后修飾實驗、STAT4穩(wěn)定性分析、CD8+T細胞共培養(yǎng)實驗、IF、IHC
參考文獻
Xiao J, Sun F, Wang YN, Liu B, Zhou P, Wang FX, Zhou HF, Ge Y, Yue TT, Luo JH, Yang CL, Rong SJ, Xiong ZZ, Ma S, Zhang Q, Xun Y, Yang CG, Luan Y, Wang SG, Wang CY, Wang ZH. UBC9 deficiency enhances immunostimulatory macrophage activation and subsequent antitumor T cell response in prostate cancer. J Clin Invest. 2023 Feb 15;133(4):e158352. doi: 10.1172/JCI158352. PMID: 36626227; PMCID: PMC9927932.