靶向m6A閱讀器YTHDF1增強(qiáng)結(jié)直腸癌的抗腫瘤免疫和抗PD-1療效

摘要
       N⁶-甲基腺苷（m⁶A）在腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）中的作用仍有待進(jìn)一步研究。在這里，作者闡明YTHN⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（YTHDF1）在大腸癌（CRC）TIME中的功能和機(jī)制。在組織微陣列（N=408）和TCGA（N=526）隊(duì)列中評(píng)估YTHDF1的臨床意義。在同基因腫瘤、腸特異性Ythdf1敲入小鼠和人源化小鼠中測(cè)定YTHDF1功能。采用單細(xì)胞RNA-seq（scRNA-seq）分析TIME。采用甲基化RNA免疫沉淀法測(cè)序（MeRIP-seq）、RNA測(cè)序（RNA-seq）和核糖體測(cè)序（Ribo-seq）鑒定YTHDF1直接靶標(biāo)。用囊泡狀納米顆粒（VNPs）包封YTHDF1-siRNA進(jìn)行YTHDF1體內(nèi)沉默。在TCGA-CRC中，YTHDF1表達(dá)與干擾素-γ基因特征負(fù)相關(guān)。與此同時(shí)，在獨(dú)立的組織微陣列隊(duì)列中，YTHDF1蛋白與CD8⁺ T細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)，暗示其在TIME中的作用?；蛉笔?em>Ythdf1增強(qiáng)CT26（MSS-CRC）和MC38（MSI-HCRC）同基因腫瘤的抗腫瘤免疫，而在偶氮甲烷-葡聚糖-硫酸鈉或Apc^Min/+模型中，Ythdf1敲入蛋白促進(jìn)免疫抑制TIME促進(jìn)結(jié)直腸癌。scRNA-seq發(fā)現(xiàn)，在Ythdf1基因敲除腫瘤中，髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）減少，同時(shí)細(xì)胞毒性T細(xì)胞增加。綜合MeRIP-seq、RNA-seq和核糖核酸-seq發(fā)現(xiàn)p65/Rela是YTHDF1的靶標(biāo)。YTHDF1促進(jìn)p65翻譯上調(diào)CXCL1，從而增加MDSC通過(guò)CXCL1-CXCR2軸的遷移。增加的MSDCs反過(guò)來(lái)在時(shí)間上拮抗功能性CD8⁺ T細(xì)胞。重要的是，通過(guò)CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）或VNPs-siYTHDF1靶向YTHDF1可提高M(jìn)SI-HCRC的抗PD1療效，并克服MSSCRC的抗PD1耐藥性。YTHDF1通過(guò)M⁶A-P65-CXCL1/CXCR2軸損害抗腫瘤免疫，促進(jìn)結(jié)直腸癌，并在免疫檢查點(diǎn)阻斷治療中作為治療靶點(diǎn)。本文于2023年8月發(fā)表在《Gut》IF:24.5期刊上。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、YTHDF1與結(jié)直腸癌中IFN-γ相關(guān)基因特征降低和預(yù)后不良相關(guān)
       通過(guò)使用TCGA數(shù)據(jù)分析21個(gè)已知的m⁶A調(diào)控子的拷貝數(shù)變化，作者鑒定出YTHDF1是m⁶A調(diào)控子在近80%的CRC腫瘤中顯示拷貝數(shù)增加或擴(kuò)增中最高。這種拷貝數(shù)的增加也與mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的上調(diào)相一致，提示YTHDF1具有促進(jìn)CRC的功能。為建立抗腫瘤免疫與m⁶A調(diào)節(jié)因子之間的聯(lián)系，該研究隨后使用GSEA分析m⁶A調(diào)節(jié)因子與IFN-γ反應(yīng)基因標(biāo)記之間的相關(guān)性。作者發(fā)現(xiàn)YTHDF1與IFN-γ反應(yīng)通路呈顯著負(fù)相關(guān)（q<0.0001）。值得注意的是，IFN-γ反應(yīng)與抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)和對(duì)ICB治療的反應(yīng)有關(guān)。一致地，YTHDF1的表達(dá)與18 IFN-γ相關(guān)的基因標(biāo)記呈強(qiáng)反相關(guān)（圖1A），這預(yù)測(cè)多種癌癥類型的抗PD1反應(yīng)性。此外，CD8A或CD8⁺ T細(xì)胞特征的表達(dá)與YTHDF1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。與TCGA數(shù)據(jù)一致，來(lái)自CRC TMA隊(duì)列的TMA IHC染色顯示，隊(duì)列I（p<0.001，r= -0.248，n=206）（圖1B）和隊(duì)列II（p<0.0001，r= -0.269，n=202）中，YTHDF1蛋白的高表達(dá)與CD8⁺ T細(xì)胞的低浸潤(rùn)相關(guān)（圖1C）。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈暗示，m⁶A閱讀器YTHDF1與抗腫瘤免疫功能受損和ICB治療效果降低有關(guān)。
       與CD8⁺ T細(xì)胞浸潤(rùn)低與預(yù)后不良相關(guān)的觀點(diǎn)一致，YTHDF1高表達(dá)（54.3%，100/184）預(yù)測(cè)CRC患者生存不良（p<0.01，log-rank檢驗(yàn)）。多因素Cox回歸分析證實(shí)，YTHDF1是隊(duì)列II中結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素（HR，1.764；95%可信區(qū)間1.058-2.939；p<0.05）。在隊(duì)列I中，通過(guò)多變量Cox回歸分析進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。
2、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示YTHDF1誘導(dǎo)的免疫抑制
       為研究YTHDF1在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用，作者使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除MC38小鼠MSI-H CRC細(xì)胞中的Ythdf1（Ythdf1-KO），并將細(xì)胞注射到同基因C57BL6小鼠（圖1D）。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組（NC）相比，敲除Ythdf1后，腫瘤體積和重量都減少（圖1E）。為了解Ythdf1-KO是否影響TIME，作者從腫瘤中分離出CD45⁺免疫細(xì)胞，并進(jìn)行單細(xì)胞RNA-seq（scRNA-seq）（NC：1480個(gè)細(xì)胞；Ythdf1-KO：1816個(gè)細(xì)胞）。與NC組相比，含有Ythdf1-KO的腫瘤表現(xiàn)出粒細(xì)胞髓源性抑制細(xì)胞（G-MDSCs，簇3）和中性粒細(xì)胞的顯著減少（圖1F）。相比之下，Ythdf1-KO腫瘤中T細(xì)胞和NK細(xì)胞大量增加（圖1F）。作者進(jìn)一步將T細(xì)胞和NK細(xì)胞重新聚集為CD4⁺ T、CD8⁺ T、NKT和NK細(xì)胞亞群，并發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，它們?cè)?em>Ythdf1-KO腫瘤中同時(shí)增加（圖1F）。因此，作者推測(cè)YTHDF1可以通過(guò)誘導(dǎo)MDSC積累來(lái)抑制抗腫瘤免疫。通過(guò)檢測(cè)MDSCs的功能標(biāo)記物Il1b、Arg2、Cxcr2和Ccr2，這些基因主要富集于MDSC簇（簇3和簇4），特別是來(lái)自未敲除Ythdf1的腫瘤（圖1G）。因此，來(lái)自該同基因模型的數(shù)據(jù)支持YTHDF1在結(jié)直腸癌中的免疫抑制功能。

圖1 在免疫功能正常的小鼠中通過(guò)scRNA-seq驗(yàn)證YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（YTHDF1）與結(jié)直腸癌（CRC）患者的免疫抑制微環(huán)境相關(guān)

3、敲除Ythdf1可減少M(fèi)DSCs，但增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤(rùn)
       為驗(yàn)證在scRNA-seq分析中的發(fā)現(xiàn)，作者用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定MC38同基因小鼠腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的組成，證實(shí)敲除Ythdf1顯著抑制腫瘤的重量和體積（圖1C）。并且流式細(xì)胞術(shù)顯示，敲除Ythdf1減少M(fèi)DSCs，但增加腫瘤中的CD8⁺ T和CD4⁺ T細(xì)胞（圖1H，I）。在MDSCs中，G-MDSCs是主要的亞群，敲除Ythdf1導(dǎo)致G-MDSCs顯著減少（圖1I）。與MDSCs的免疫抑制功能一致，作者觀察到Ythdf1-KO組功能T細(xì)胞顯著增加，包括IFN-γ⁺ CD8⁺ T細(xì)胞、顆粒酶B⁺ CD8⁺ T細(xì)胞和IFN-γ⁺ CD4⁺ T細(xì)胞（圖1H，J）。
       接下來(lái)，作者在CT26（MSS-CRC）中與Ythdf1-KO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證YTHDF1在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用。正如預(yù)期的那樣，Ythdf1-KO導(dǎo)致CT26同基因小鼠腫瘤體積和重量減?。▓D2A，B），同時(shí)功能T細(xì)胞減少和MDSCs積累（圖2C，D）。免疫熒光染色證實(shí)，Ythdf1基因敲除后，MC38和CT26同基因腫瘤中MDSCs（CD11b⁺ Gr-1⁺）的浸潤(rùn)減少（圖2E）?？偟膩?lái)說(shuō)，結(jié)直腸癌細(xì)胞中Ythdf1的缺失減少M(fèi)DSCs，增加功能性T細(xì)胞的浸潤(rùn)。這些發(fā)現(xiàn)與臨床數(shù)據(jù)一致，顯示YTHDF1與CD8⁺ T細(xì)胞和IFN-γ相關(guān)的特征（圖1A-C）。
       作者想知道在Ythdf1-KO中減弱的腫瘤形成是否依賴于CD8⁺ T細(xì)胞抗腫瘤免疫。為解決這個(gè)問(wèn)題，作者在MC38同基因模型中使用抗CD8抗體去除CD8⁺ T細(xì)胞。與假設(shè)一致，CD8⁺ T細(xì)胞的消耗恢復(fù)Ythdf1-KO腫瘤的生長(zhǎng)（圖2F，G），表明Ythdf1-KO的腫瘤抑制功能至少部分依賴于CD8⁺ T細(xì)胞。這在CT26同基因小鼠中得到證實(shí)，表明抗CD8抗體治療可以挽救Ythdf1-KO組中被抑制的腫瘤生長(zhǎng)（圖2H，I）?？傊?，Ythdf1敲除通過(guò)誘導(dǎo)CD8⁺ T細(xì)胞依賴性抗腫瘤免疫抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)。

圖2 YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（Ythdf1）敲除通過(guò)減少髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）和增加同源腫瘤中的功能性T細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，這種作用被CD8⁺ T細(xì)胞消耗逆轉(zhuǎn)

4、腸道特異性Ythdf1敲入促進(jìn)小鼠結(jié)直腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫
       為驗(yàn)證YTHDF1在自發(fā)性結(jié)直腸腫瘤發(fā)生中的作用，作者構(gòu)建腸道特異性的Ythdf1敲入小鼠（Ythdf1^loxp/loxp CDX2-cre），并通過(guò)AOM/DSS治療在這些小鼠中啟動(dòng)CRC（圖3A），發(fā)現(xiàn)在AOM/DSS模型中，Ythdf1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤數(shù)量和大小增加（圖3C）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，與野生型小鼠相比，Ythdf1敲入小鼠結(jié)腸腫瘤中MDSC浸潤(rùn)增加，NK、CD4⁺ T和CD8⁺ T細(xì)胞減少（圖3D）。此外，作者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)顆粒酶B、INF-γ和TNF-α的表達(dá)，Ythdf1敲入降低功能性T細(xì)胞的比例（圖3E）。
       接下來(lái)，作者通過(guò)建立Apc^Min/+ Ythdf1^loxp/loxp CDX2-cre小鼠，試圖在Apc^Min/+驅(qū)動(dòng)的自發(fā)性CRC中驗(yàn)證這些結(jié)果（圖3B）。與此一致的是，腸道特異性敲入Ythdf1的Apc^Min/+小鼠的結(jié)腸腫瘤明顯大于野生型小鼠（圖3C）。腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)Apc^Min/+敲入Ythdf1后，腫瘤中NK、CD4⁺ T和CD8⁺ T細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著減少，同時(shí)MDSCs誘導(dǎo)增加（圖3F）。此外，Ythdf1敲入降低Apc^Min/+小鼠的顆粒酶B⁺、INF-γ⁺或TNF-α⁺ T細(xì)胞（圖3G）?？傊?，這些結(jié)果支持YTHDF1培養(yǎng)促進(jìn)自發(fā)性CRC的免疫抑制微環(huán)境。

圖3 腸道特異性YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（Ythdf1）敲入促進(jìn)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫。

5、通過(guò)VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1增強(qiáng)CD34⁺人源化小鼠的抗腫瘤免疫
       為證實(shí)YTHDF1在調(diào)節(jié)人抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用，作者建立CD34⁺人源化小鼠模型小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）含有>20%的人CD45⁺細(xì)胞（圖4A）。為在體內(nèi)靶向YTHDF1，作者開發(fā)VNPs來(lái)攜帶針對(duì)YTHDF1的siRNA。在腫瘤達(dá)到50-100 mm³后，攜帶人結(jié)直腸癌HCT116異種移植物的人源化NSG小鼠接受VNP-siNC或-siYTHDF1治療（圖4B）。與VNP-siNC相比，VNP-siYTHDF1顯著抑制腫瘤體積和重量（圖4B，C）。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析TIME（圖4D）。VNP-siYTHDF1減少M(fèi)DSC浸潤(rùn)，但增加CD4⁺ T細(xì)胞、CD8⁺ T細(xì)胞和NK細(xì)胞積聚（圖4E）。此外，在接受VNP-siYTHDF1的腫瘤中發(fā)現(xiàn)更多的IFN-γ⁺、TNF-α⁺和顆粒酶B⁺ CD8⁺ T細(xì)胞（圖4E）。因此，利用VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1是增強(qiáng)人源化小鼠抗腫瘤免疫的一種安全有效的手段。

圖4 VNP-siYTHDF1增強(qiáng)CD34⁺人源化小鼠的抗腫瘤免疫

6、YTHDF1促進(jìn)p65翻譯激活TNF/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)
       為確定YTHDF1引發(fā)免疫抑制的分子機(jī)制，作者在敲除或不敲除YTHDF1的CRC細(xì)胞中進(jìn)行Ribo-seq。Ribo-seq數(shù)據(jù)顯示，YTHDF1的缺失與TNF信號(hào)的失活顯著相關(guān)（圖5A）。因此，YTHDF1敲除減少參與TNF信號(hào)傳導(dǎo)的核糖體保護(hù)片段基因豐度（圖5A）。因此，YTHDF1可以通過(guò)促進(jìn)蛋白翻譯調(diào)節(jié)TNF/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。由于YTHDF1具有m⁶A閱讀器的功能，作者接下來(lái)進(jìn)行m⁶A免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）以確定m⁶A修飾的轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)篩選參與TNF信號(hào)傳導(dǎo)的mRNA中的m⁶A峰，作者確定兩個(gè)靠近p65 mRNA終止密碼子的m⁶A位點(diǎn)（圖5B），并通過(guò)MeRIP-qPCR驗(yàn)證這一點(diǎn)（圖5C）。重要的是，通過(guò)RNA免疫沉淀（RIP）測(cè)序和抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)YTHDF1和p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5D）。因此，p65 mRNA是YTHDF1的直接靶點(diǎn)。作者發(fā)現(xiàn)在CT26和MC38細(xì)胞中，敲除Ythdf1降低p65蛋白的表達(dá)，尤其是核p65的表達(dá)，而不影響NF-κB通路的其他調(diào)節(jié)因子如IKKα和iκBα的表達(dá)（圖5E）。在人類結(jié)直腸癌細(xì)胞中獲得一致的結(jié)果，顯示野生型YTHDF1過(guò)表達(dá)，而非功能失調(diào)突變體，p65蛋白表達(dá)升高；相反，YTHDF1敲低會(huì)減弱人類結(jié)直腸癌細(xì)胞中的p65蛋白（圖5F）。使用抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR也證實(shí)人結(jié)直腸癌細(xì)胞中YTHDF1與p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5G）。接下來(lái)，作者試圖在體內(nèi)驗(yàn)證YTHDF1和p65的關(guān)聯(lián)。在敲入Ythdf1的小鼠中，結(jié)腸腫瘤中的p65和phospho-p65蛋白均升高（圖5H）?？傊琘THDF1促進(jìn)p65蛋白的表達(dá)，在體外和體內(nèi)激活TNF和NF-κB信號(hào)。

圖5 YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（YTHDF1）通過(guò)促進(jìn)RELA （p65） mRNA翻譯促進(jìn)CRC中TNF/NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)

7、YTHDF1通過(guò)p65-CXCL1軸促進(jìn)MDSC遷移
       為了解YTHDF1誘導(dǎo)的p65與其免疫抑制之間的聯(lián)系，作者在CRC細(xì)胞、腫瘤裂解物和同源腫瘤小鼠血清的條件培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞因子多重免疫測(cè)定，檢測(cè)23種不同的小鼠細(xì)胞因子。在這些細(xì)胞因子中，Ythdf1-KO持續(xù)降低CXCL1（圖6A），并且通過(guò)ELISA檢測(cè)證實(shí)CXCL1的這種降低（圖6B）。據(jù)報(bào)道，CXCL1是NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，它通過(guò)與其受體CXCR2的相互作用促進(jìn)MDSC趨化。鑒于Ythdf1-KO在CRC TIME減少M(fèi)DSC的浸潤(rùn)，作者想知道YTHDF1是否調(diào)節(jié)MDSC的遷移。因此，作者進(jìn)行MDSC體外遷移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自野生型CRC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基增強(qiáng)MDSC的遷移，而這種遷移被Ythdf1的敲除所破壞（圖6C）。通過(guò)CXCR2抑制劑SB265610阻斷CXCL1-CXCR2相互作用，消除對(duì)照組和Ythdf1-KO培養(yǎng)上清在介導(dǎo)MDSC遷移方面的差異（圖6C）。因此，YTHDF1通過(guò)CXCL1/CXCR2軸促進(jìn)MDSC遷移。接下來(lái)，作者想知道YTHDF1是否可以調(diào)節(jié)Cxcl1 mRNA的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，敲除Ythdf1顯著抑制小鼠（圖6D）和人CRC細(xì)胞系中Cxcl1 mRNA的水平。因此，研究結(jié)果支持YTHDF1-p65-CXCL1/CXCR2軸介導(dǎo)CRC中MDSC的遷移。
       接下來(lái)，作者研究YTHDF1是否影響MDSC功能。從MC38同基因腫瘤中分離CD11b⁺ Gr-1⁺ MDSCs，然后與T細(xì)胞體外共培養(yǎng)（圖6E）。從對(duì)照腫瘤中分離的MDSCs抑制T細(xì)胞增殖；然而，與來(lái)自對(duì)照組的MDSCs相比，來(lái)自Ythdf1-KO腫瘤的MDSCs對(duì)CD8⁺ T細(xì)胞和CD4⁺ T細(xì)胞的增殖抑制活性明顯降低（圖6F，G）。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證MDSCs對(duì)關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞（包括CD8⁺ T細(xì)胞和CD4⁺ T細(xì)胞）的免疫抑制功能，并支持表達(dá)YTHDF1的CRC招募功能性MDSCs。

圖6 YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（Ythdf1）的缺失通過(guò)減少CXCL1的分泌來(lái)促進(jìn)髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）的減少。

8、YTHDF1是CRC免疫治療的潛在治療靶點(diǎn)
       考慮到MDSCs浸潤(rùn)減少已被報(bào)道與各種癌癥類型的免疫治療效果增強(qiáng)相關(guān)，作者試圖測(cè)試靶向YTHDF1是否能增強(qiáng)CRC的抗PD1治療。正如預(yù)期的那樣，作者發(fā)現(xiàn)敲除Ythdf1增強(qiáng)MC38 （MSI-H）同基因腫瘤中抗PD1的功效，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期（圖7A）。作者進(jìn)一步利用VNPs系統(tǒng)將特異性Ythdf1-siRNA傳遞到腫瘤中。當(dāng)MC38同基因腫瘤達(dá)到50~100 mm³時(shí)，作者用VNP-siYthdf1（或VNP-siNC）和抗PD1（或IgG）治療小鼠。與VNP-siNC相比，VNP-siYthdf1顯著抑制MC38腫瘤生長(zhǎng)（圖7B，C）。值得注意的是，VNP-siYthdf1與anti-PD1聯(lián)合使用對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)（圖7B,C）。
       基于同基因CT26（MSS CRC）腫瘤模型，作者進(jìn)一步研究靶向YTHDF1是否可以克服MSS CRC的抗PD1耐藥性。因此，將敲除Ythdf1的CT26細(xì)胞注射到同基因小鼠體內(nèi)，并用PD1抗體處理，發(fā)現(xiàn)敲除Ythdf1顯著增強(qiáng)CT26同基因腫瘤的抗PD1治療效果，否則這些腫瘤對(duì)ICB治療無(wú)反應(yīng)（圖7D，E）。
       流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步顯示，在CT26和MC38同基因模型中，Ythdf1沉默和抗PD1聯(lián)合使用可顯著增加腫瘤浸潤(rùn)的功能性CD8⁺ T細(xì)胞，包括IFN-γ⁺ CD8⁺ T細(xì)胞和顆粒酶B⁺ CD8⁺ T細(xì)胞（圖7F，G）。此外，聯(lián)合治療顯著減少M(fèi)DSCs的積累，同時(shí)誘導(dǎo)CD4⁺ T細(xì)胞和CD8⁺ T細(xì)胞（圖7G）。因此，靶向YTHDF1不僅可以增強(qiáng)ICB在MSI-H型CRC中的治療效果，還可以通過(guò)抑制MDSCs的募集和改善CD8⁺ T細(xì)胞的功能來(lái)克服MSS型CRC中的ICB耐藥性。
       在這里，作者發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中消耗Ythdf1會(huì)抑制腫瘤內(nèi)的MDSCs，并減輕MDSCs對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的免疫抑制功能。MDSCs和T細(xì)胞共培養(yǎng)研究表明，與對(duì)照腫瘤相比，來(lái)自Ythdf1-KO腫瘤的MDSCs抑制CD8+ T細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞增殖的能力受損。因此，研究結(jié)果支持YTHDF1介導(dǎo)功能性MSDCs的募集，這抑制CRC中效應(yīng)T細(xì)胞的功能和增殖，導(dǎo)致免疫監(jiān)視功能受損（圖7H）。

圖7 靶向YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（YTHDF1）增強(qiáng)抗PD1阻斷治療在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（MSI-H）和微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌（CRC）中的應(yīng)用

       綜上所述，YTHDF1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)通過(guò)激活m6 A-p65-CXCL1軸募集免疫抑制性MDSCs抑制T細(xì)胞，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。靶向YTHDF1加抗PD1治療對(duì)結(jié)直腸癌有良好的抗腫瘤療效，證實(shí)YTHDF1是結(jié)直腸癌的潛在治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法
人源化小鼠模型，TCGA數(shù)據(jù)分析，CRISPR/Cas9敲除，穩(wěn)定細(xì)胞系過(guò)表達(dá)，同基因小鼠模型，RT-qPCR，免疫組織化學(xué)，免疫熒光，Western blot，酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA），RNA干擾，囊泡樣plga基納米顆粒(VNP)配方，流式細(xì)胞術(shù)分析，單細(xì)胞RNA測(cè)序，MDSC分離及遷移試驗(yàn)，細(xì)胞因子多重免疫測(cè)定，核糖體測(cè)序，MeRIP測(cè)序和MeRIP-qPCR，RIP-測(cè)序或RIP-qPCR，肝腎功能指標(biāo)測(cè)定
參考文獻(xiàn)
Bao Y, Zhai J, Chen H, et al. Targeting m⁶A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer. Gut. 2023; 72 (8): 1497-1509. doi: 10.1136/gutjnl-2022-328845