靶向m6A閱讀器YTHDF1增強結(jié)直腸癌的抗腫瘤免疫和抗PD-1療效

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2024-03-19
本研究闡明YTHN6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1(YTHDF1)在大腸癌(CRC)TIME中的功能和機制......

摘要
       N6-甲基腺苷(m6A)在腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)中的作用仍有待進一步研究。在這里,作者闡明YTHN6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1(YTHDF1)在大腸癌(CRC)TIME中的功能和機制。在組織微陣列(N=408)和TCGA(N=526)隊列中評估YTHDF1的臨床意義。在同基因腫瘤、腸特異性Ythdf1敲入小鼠和人源化小鼠中測定YTHDF1功能。采用單細胞RNA-seq(scRNA-seq)分析TIME。采用甲基化RNA免疫沉淀法測序(MeRIP-seq)、RNA測序(RNA-seq)和核糖體測序(Ribo-seq)鑒定YTHDF1直接靶標(biāo)。用囊泡狀納米顆粒(VNPs)包封YTHDF1-siRNA進行YTHDF1體內(nèi)沉默。在TCGA-CRC中,YTHDF1表達與干擾素-γ基因特征負相關(guān)。與此同時,在獨立的組織微陣列隊列中,YTHDF1蛋白與CD8+ T細胞浸潤呈負相關(guān),暗示其在TIME中的作用?;蛉笔?em>Ythdf1增強CT26(MSS-CRC)和MC38(MSI-HCRC)同基因腫瘤的抗腫瘤免疫,而在偶氮甲烷-葡聚糖-硫酸鈉或ApcMin/+模型中,Ythdf1敲入蛋白促進免疫抑制TIME促進結(jié)直腸癌。scRNA-seq發(fā)現(xiàn),在Ythdf1基因敲除腫瘤中,髓源性抑制細胞(MDSCs)減少,同時細胞毒性T細胞增加。綜合MeRIP-seq、RNA-seq和核糖核酸-seq發(fā)現(xiàn)p65/Rela是YTHDF1的靶標(biāo)。YTHDF1促進p65翻譯上調(diào)CXCL1,從而增加MDSC通過CXCL1-CXCR2軸的遷移。增加的MSDCs反過來在時間上拮抗功能性CD8+ T細胞。重要的是,通過CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)或VNPs-siYTHDF1靶向YTHDF1可提高MSI-HCRC的抗PD1療效,并克服MSSCRC的抗PD1耐藥性。YTHDF1通過M6A-P65-CXCL1/CXCR2軸損害抗腫瘤免疫,促進結(jié)直腸癌,并在免疫檢查點阻斷治療中作為治療靶點。本文于2023年8月發(fā)表在《Gut》IF:24.5期刊上。
技術(shù)路線


主要實驗結(jié)果
1、YTHDF1與結(jié)直腸癌中IFN-γ相關(guān)基因特征降低和預(yù)后不良相關(guān)

       通過使用TCGA數(shù)據(jù)分析21個已知的m6A調(diào)控子的拷貝數(shù)變化,作者鑒定出YTHDF1是m6A調(diào)控子在近80%的CRC腫瘤中顯示拷貝數(shù)增加或擴增中最高。這種拷貝數(shù)的增加也與mRNA表達和蛋白表達的上調(diào)相一致,提示YTHDF1具有促進CRC的功能。為建立抗腫瘤免疫與m6A調(diào)節(jié)因子之間的聯(lián)系,該研究隨后使用GSEA分析m6A調(diào)節(jié)因子與IFN-γ反應(yīng)基因標(biāo)記之間的相關(guān)性。作者發(fā)現(xiàn)YTHDF1與IFN-γ反應(yīng)通路呈顯著負相關(guān)(q<0.0001)。值得注意的是,IFN-γ反應(yīng)與抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)和對ICB治療的反應(yīng)有關(guān)。一致地,YTHDF1的表達與18 IFN-γ相關(guān)的基因標(biāo)記呈強反相關(guān)(圖1A),這預(yù)測多種癌癥類型的抗PD1反應(yīng)性。此外,CD8A或CD8+ T細胞特征的表達與YTHDF1表達呈負相關(guān)。與TCGA數(shù)據(jù)一致,來自CRC TMA隊列的TMA IHC染色顯示,隊列I(p<0.001,r= -0.248,n=206)(圖1B)和隊列II(p<0.0001,r= -0.269,n=202)中,YTHDF1蛋白的高表達與CD8+ T細胞的低浸潤相關(guān)(圖1C)。這些數(shù)據(jù)強烈暗示,m6A閱讀器YTHDF1與抗腫瘤免疫功能受損和ICB治療效果降低有關(guān)。
       與CD8+ T細胞浸潤低與預(yù)后不良相關(guān)的觀點一致,YTHDF1高表達(54.3%,100/184)預(yù)測CRC患者生存不良(p<0.01,log-rank檢驗)。多因素Cox回歸分析證實,YTHDF1是隊列II中結(jié)直腸癌的獨立預(yù)后因素(HR,1.764;95%可信區(qū)間1.058-2.939;p<0.05)。在隊列I中,通過多變量Cox回歸分析進一步驗證這些發(fā)現(xiàn)。
2、單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示YTHDF1誘導(dǎo)的免疫抑制
       為研究YTHDF1在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用,作者使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除MC38小鼠MSI-H CRC細胞中的Ythdf1Ythdf1-KO),并將細胞注射到同基因C57BL6小鼠(圖1D)。發(fā)現(xiàn)與對照組(NC)相比,敲除Ythdf1后,腫瘤體積和重量都減少(圖1E)。為了解Ythdf1-KO是否影響TIME,作者從腫瘤中分離出CD45+免疫細胞,并進行單細胞RNA-seq(scRNA-seq)(NC:1480個細胞;Ythdf1-KO:1816個細胞)。與NC組相比,含有Ythdf1-KO的腫瘤表現(xiàn)出粒細胞髓源性抑制細胞(G-MDSCs,簇3)和中性粒細胞的顯著減少(圖1F)。相比之下,Ythdf1-KO腫瘤中T細胞和NK細胞大量增加(圖1F)。作者進一步將T細胞和NK細胞重新聚集為CD4+ T、CD8+ T、NKT和NK細胞亞群,并發(fā)現(xiàn)與對照組相比,它們在Ythdf1-KO腫瘤中同時增加(圖1F)。因此,作者推測YTHDF1可以通過誘導(dǎo)MDSC積累來抑制抗腫瘤免疫。通過檢測MDSCs的功能標(biāo)記物Il1b、Arg2、Cxcr2Ccr2,這些基因主要富集于MDSC簇(簇3和簇4),特別是來自未敲除Ythdf1的腫瘤(圖1G)。因此,來自該同基因模型的數(shù)據(jù)支持YTHDF1在結(jié)直腸癌中的免疫抑制功能。


圖1 在免疫功能正常的小鼠中通過scRNA-seq驗證YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1(YTHDF1)與結(jié)直腸癌(CRC)患者的免疫抑制微環(huán)境相關(guān)


3、敲除Ythdf1可減少MDSCs,但增加細胞毒性T細胞浸潤
       為驗證在scRNA-seq分析中的發(fā)現(xiàn),作者用流式細胞術(shù)測定MC38同基因小鼠腫瘤浸潤免疫細胞的組成,證實敲除Ythdf1顯著抑制腫瘤的重量和體積(圖1C)。并且流式細胞術(shù)顯示,敲除Ythdf1減少MDSCs,但增加腫瘤中的CD8+ T和CD4+ T細胞(圖1H,I)。在MDSCs中,G-MDSCs是主要的亞群,敲除Ythdf1導(dǎo)致G-MDSCs顯著減少(圖1I)。與MDSCs的免疫抑制功能一致,作者觀察到Ythdf1-KO組功能T細胞顯著增加,包括IFN-γ+ CD8+ T細胞、顆粒酶B+ CD8+ T細胞和IFN-γ+ CD4+ T細胞(圖1H,J)。
       接下來,作者在CT26(MSS-CRC)中與Ythdf1-KO進行實驗,以驗證YTHDF1在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用。正如預(yù)期的那樣,Ythdf1-KO導(dǎo)致CT26同基因小鼠腫瘤體積和重量減?。▓D2A,B),同時功能T細胞減少和MDSCs積累(圖2C,D)。免疫熒光染色證實,Ythdf1基因敲除后,MC38和CT26同基因腫瘤中MDSCs(CD11b+ Gr-1+)的浸潤減少(圖2E)??偟膩碚f,結(jié)直腸癌細胞中Ythdf1的缺失減少MDSCs,增加功能性T細胞的浸潤。這些發(fā)現(xiàn)與臨床數(shù)據(jù)一致,顯示YTHDF1與CD8+ T細胞和IFN-γ相關(guān)的特征(圖1A-C)。
       作者想知道在Ythdf1-KO中減弱的腫瘤形成是否依賴于CD8+ T細胞抗腫瘤免疫。為解決這個問題,作者在MC38同基因模型中使用抗CD8抗體去除CD8+ T細胞。與假設(shè)一致,CD8+ T細胞的消耗恢復(fù)Ythdf1-KO腫瘤的生長(圖2F,G),表明Ythdf1-KO的腫瘤抑制功能至少部分依賴于CD8+ T細胞。這在CT26同基因小鼠中得到證實,表明抗CD8抗體治療可以挽救Ythdf1-KO組中被抑制的腫瘤生長(圖2H,I)。總之,Ythdf1敲除通過誘導(dǎo)CD8+ T細胞依賴性抗腫瘤免疫抑制結(jié)直腸癌的生長。


圖2 YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1(Ythdf1)敲除通過減少髓源性抑制細胞(MDSC)和增加同源腫瘤中的功能性T細胞來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫,這種作用被CD8+ T細胞消耗逆轉(zhuǎn)


4、腸道特異性Ythdf1敲入促進小鼠結(jié)直腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫
       為驗證YTHDF1在自發(fā)性結(jié)直腸腫瘤發(fā)生中的作用,作者構(gòu)建腸道特異性的Ythdf1敲入小鼠(Ythdf1loxp/loxp CDX2-cre),并通過AOM/DSS治療在這些小鼠中啟動CRC(圖3A),發(fā)現(xiàn)在AOM/DSS模型中,Ythdf1的過表達導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤數(shù)量和大小增加(圖3C)。流式細胞術(shù)顯示,與野生型小鼠相比,Ythdf1敲入小鼠結(jié)腸腫瘤中MDSC浸潤增加,NK、CD4+ T和CD8+ T細胞減少(圖3D)。此外,作者發(fā)現(xiàn),通過檢測顆粒酶B、INF-γ和TNF-α的表達,Ythdf1敲入降低功能性T細胞的比例(圖3E)。
       接下來,作者通過建立ApcMin/+ Ythdf1loxp/loxp CDX2-cre小鼠,試圖在ApcMin/+驅(qū)動的自發(fā)性CRC中驗證這些結(jié)果(圖3B)。與此一致的是,腸道特異性敲入Ythdf1ApcMin/+小鼠的結(jié)腸腫瘤明顯大于野生型小鼠(圖3C)。腫瘤浸潤性免疫細胞分析發(fā)現(xiàn)ApcMin/+敲入Ythdf1后,腫瘤中NK、CD4+ T和CD8+ T細胞的浸潤顯著減少,同時MDSCs誘導(dǎo)增加(圖3F)。此外,Ythdf1敲入降低ApcMin/+小鼠的顆粒酶B+、INF-γ+或TNF-α+ T細胞(圖3G)??傊@些結(jié)果支持YTHDF1培養(yǎng)促進自發(fā)性CRC的免疫抑制微環(huán)境。


圖3 腸道特異性YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1(Ythdf1)敲入促進小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫。


5、通過VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1增強CD34+人源化小鼠的抗腫瘤免疫
       為證實YTHDF1在調(diào)節(jié)人抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用,作者建立CD34+人源化小鼠模型小鼠外周血單個核細胞(PBMCs)含有>20%的人CD45+細胞(圖4A)。為在體內(nèi)靶向YTHDF1,作者開發(fā)VNPs來攜帶針對YTHDF1的siRNA。在腫瘤達到50-100 mm3后,攜帶人結(jié)直腸癌HCT116異種移植物的人源化NSG小鼠接受VNP-siNC或-siYTHDF1治療(圖4B)。與VNP-siNC相比,VNP-siYTHDF1顯著抑制腫瘤體積和重量(圖4B,C)。進行流式細胞術(shù)分析TIME(圖4D)。VNP-siYTHDF1減少MDSC浸潤,但增加CD4+ T細胞、CD8+ T細胞和NK細胞積聚(圖4E)。此外,在接受VNP-siYTHDF1的腫瘤中發(fā)現(xiàn)更多的IFN-γ+、TNF-α+和顆粒酶B+ CD8+ T細胞(圖4E)。因此,利用VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1是增強人源化小鼠抗腫瘤免疫的一種安全有效的手段。


圖4 VNP-siYTHDF1增強CD34+人源化小鼠的抗腫瘤免疫


6、YTHDF1促進p65翻譯激活TNF/NF-κB信號傳導(dǎo)
       為確定YTHDF1引發(fā)免疫抑制的分子機制,作者在敲除或不敲除YTHDF1的CRC細胞中進行Ribo-seq。Ribo-seq數(shù)據(jù)顯示,YTHDF1的缺失與TNF信號的失活顯著相關(guān)(圖5A)。因此,YTHDF1敲除減少參與TNF信號傳導(dǎo)的核糖體保護片段基因豐度(圖5A)。因此,YTHDF1可以通過促進蛋白翻譯調(diào)節(jié)TNF/NF-κB信號傳導(dǎo)。由于YTHDF1具有m6A閱讀器的功能,作者接下來進行m6A免疫沉淀測序(MeRIP-seq)以確定m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本。通過篩選參與TNF信號傳導(dǎo)的mRNA中的m6A峰,作者確定兩個靠近p65 mRNA終止密碼子的m6A位點(圖5B),并通過MeRIP-qPCR驗證這一點(圖5C)。重要的是,通過RNA免疫沉淀(RIP)測序和抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)YTHDF1和p65 mRNA之間的直接相互作用(圖5D)。因此,p65 mRNA是YTHDF1的直接靶點。作者發(fā)現(xiàn)在CT26和MC38細胞中,敲除Ythdf1降低p65蛋白的表達,尤其是核p65的表達,而不影響NF-κB通路的其他調(diào)節(jié)因子如IKKα和iκBα的表達(圖5E)。在人類結(jié)直腸癌細胞中獲得一致的結(jié)果,顯示野生型YTHDF1過表達,而非功能失調(diào)突變體,p65蛋白表達升高;相反,YTHDF1敲低會減弱人類結(jié)直腸癌細胞中的p65蛋白(圖5F)。使用抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR也證實人結(jié)直腸癌細胞中YTHDF1與p65 mRNA之間的直接相互作用(圖5G)。接下來,作者試圖在體內(nèi)驗證YTHDF1和p65的關(guān)聯(lián)。在敲入Ythdf1的小鼠中,結(jié)腸腫瘤中的p65和phospho-p65蛋白均升高(圖5H)??傊琘THDF1促進p65蛋白的表達,在體外和體內(nèi)激活TNF和NF-κB信號。


圖5 YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1(YTHDF1)通過促進RELA (p65) mRNA翻譯促進CRC中TNF/NF-kB信號傳導(dǎo)


7、YTHDF1通過p65-CXCL1軸促進MDSC遷移
       為了解YTHDF1誘導(dǎo)的p65與其免疫抑制之間的聯(lián)系,作者在CRC細胞、腫瘤裂解物和同源腫瘤小鼠血清的條件培養(yǎng)基中進行細胞因子多重免疫測定,檢測23種不同的小鼠細胞因子。在這些細胞因子中,Ythdf1-KO持續(xù)降低CXCL1(圖6A),并且通過ELISA檢測證實CXCL1的這種降低(圖6B)。據(jù)報道,CXCL1是NF-κB信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄靶點,它通過與其受體CXCR2的相互作用促進MDSC趨化。鑒于Ythdf1-KO在CRC TIME減少MDSC的浸潤,作者想知道YTHDF1是否調(diào)節(jié)MDSC的遷移。因此,作者進行MDSC體外遷移實驗,發(fā)現(xiàn)來自野生型CRC細胞的條件培養(yǎng)基增強MDSC的遷移,而這種遷移被Ythdf1的敲除所破壞(圖6C)。通過CXCR2抑制劑SB265610阻斷CXCL1-CXCR2相互作用,消除對照組和Ythdf1-KO培養(yǎng)上清在介導(dǎo)MDSC遷移方面的差異(圖6C)。因此,YTHDF1通過CXCL1/CXCR2軸促進MDSC遷移。接下來,作者想知道YTHDF1是否可以調(diào)節(jié)Cxcl1 mRNA的表達。正如預(yù)期的那樣,敲除Ythdf1顯著抑制小鼠(圖6D)和人CRC細胞系中Cxcl1 mRNA的水平。因此,研究結(jié)果支持YTHDF1-p65-CXCL1/CXCR2軸介導(dǎo)CRC中MDSC的遷移。
       接下來,作者研究YTHDF1是否影響MDSC功能。從MC38同基因腫瘤中分離CD11b+ Gr-1+ MDSCs,然后與T細胞體外共培養(yǎng)(圖6E)。從對照腫瘤中分離的MDSCs抑制T細胞增殖;然而,與來自對照組的MDSCs相比,來自Ythdf1-KO腫瘤的MDSCs對CD8+ T細胞和CD4+ T細胞的增殖抑制活性明顯降低(圖6F,G)。這些數(shù)據(jù)驗證MDSCs對關(guān)鍵效應(yīng)細胞(包括CD8+ T細胞和CD4+ T細胞)的免疫抑制功能,并支持表達YTHDF1的CRC招募功能性MDSCs。


圖6 YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1(Ythdf1)的缺失通過減少CXCL1的分泌來促進髓源性抑制細胞(MDSCs)的減少。


8、YTHDF1是CRC免疫治療的潛在治療靶點
       考慮到MDSCs浸潤減少已被報道與各種癌癥類型的免疫治療效果增強相關(guān),作者試圖測試靶向YTHDF1是否能增強CRC的抗PD1治療。正如預(yù)期的那樣,作者發(fā)現(xiàn)敲除Ythdf1增強MC38 (MSI-H)同基因腫瘤中抗PD1的功效,延長荷瘤小鼠的生存期(圖7A)。作者進一步利用VNPs系統(tǒng)將特異性Ythdf1-siRNA傳遞到腫瘤中。當(dāng)MC38同基因腫瘤達到50~100 mm3時,作者用VNP-siYthdf1(或VNP-siNC)和抗PD1(或IgG)治療小鼠。與VNP-siNC相比,VNP-siYthdf1顯著抑制MC38腫瘤生長(圖7B,C)。值得注意的是,VNP-siYthdf1與anti-PD1聯(lián)合使用對腫瘤生長的抑制作用最強(圖7B,C)。
       基于同基因CT26(MSS CRC)腫瘤模型,作者進一步研究靶向YTHDF1是否可以克服MSS CRC的抗PD1耐藥性。因此,將敲除Ythdf1的CT26細胞注射到同基因小鼠體內(nèi),并用PD1抗體處理,發(fā)現(xiàn)敲除Ythdf1顯著增強CT26同基因腫瘤的抗PD1治療效果,否則這些腫瘤對ICB治療無反應(yīng)(圖7D,E)。
       流式細胞術(shù)分析進一步顯示,在CT26和MC38同基因模型中,Ythdf1沉默和抗PD1聯(lián)合使用可顯著增加腫瘤浸潤的功能性CD8+ T細胞,包括IFN-γ+ CD8+ T細胞和顆粒酶B+ CD8+ T細胞(圖7F,G)。此外,聯(lián)合治療顯著減少MDSCs的積累,同時誘導(dǎo)CD4+ T細胞和CD8+ T細胞(圖7G)。因此,靶向YTHDF1不僅可以增強ICB在MSI-H型CRC中的治療效果,還可以通過抑制MDSCs的募集和改善CD8+ T細胞的功能來克服MSS型CRC中的ICB耐藥性。
       在這里,作者發(fā)現(xiàn)在癌細胞中消耗Ythdf1會抑制腫瘤內(nèi)的MDSCs,并減輕MDSCs對效應(yīng)細胞的免疫抑制功能。MDSCs和T細胞共培養(yǎng)研究表明,與對照腫瘤相比,來自Ythdf1-KO腫瘤的MDSCs抑制CD8+ T細胞和CD4+ T細胞增殖的能力受損。因此,研究結(jié)果支持YTHDF1介導(dǎo)功能性MSDCs的募集,這抑制CRC中效應(yīng)T細胞的功能和增殖,導(dǎo)致免疫監(jiān)視功能受損(圖7H)。


圖7 靶向YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1(YTHDF1)增強抗PD1阻斷治療在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高(MSI-H)和微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌(CRC)中的應(yīng)用


       綜上所述,YTHDF1在結(jié)直腸癌中的表達通過激活m6 A-p65-CXCL1軸募集免疫抑制性MDSCs抑制T細胞,從而促進結(jié)直腸癌的發(fā)生。靶向YTHDF1加抗PD1治療對結(jié)直腸癌有良好的抗腫瘤療效,證實YTHDF1是結(jié)直腸癌的潛在治療靶點。

實驗方法
人源化小鼠模型,TCGA數(shù)據(jù)分析,CRISPR/Cas9敲除,穩(wěn)定細胞系過表達,同基因小鼠模型,RT-qPCR,免疫組織化學(xué),免疫熒光,Western blot,酶聯(lián)免疫測定(ELISA),RNA干擾,囊泡樣plga基納米顆粒(VNP)配方,流式細胞術(shù)分析,單細胞RNA測序,MDSC分離及遷移試驗,細胞因子多重免疫測定,核糖體測序,MeRIP測序和MeRIP-qPCR,RIP-測序或RIP-qPCR,肝腎功能指標(biāo)測定
參考文獻
Bao Y, Zhai J, Chen H, et al. Targeting m6A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer. Gut. 2023; 72 (8): 1497-1509. doi: 10.1136/gutjnl-2022-328845