靶向m6A閱讀器YTHDF1增強結(jié)直腸癌的抗腫瘤免疫和抗PD-1療效

摘要
       N⁶-甲基腺苷（m⁶A）在腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）中的作用仍有待進一步研究。在這里，作者闡明YTHN⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（YTHDF1）在大腸癌（CRC）TIME中的功能和機制。在組織微陣列（N=408）和TCGA（N=526）隊列中評估YTHDF1的臨床意義。在同基因腫瘤、腸特異性Ythdf1敲入小鼠和人源化小鼠中測定YTHDF1功能。采用單細胞RNA-seq（scRNA-seq）分析TIME。采用甲基化RNA免疫沉淀法測序（MeRIP-seq）、RNA測序（RNA-seq）和核糖體測序（Ribo-seq）鑒定YTHDF1直接靶標(biāo)。用囊泡狀納米顆粒（VNPs）包封YTHDF1-siRNA進行YTHDF1體內(nèi)沉默。在TCGA-CRC中，YTHDF1表達與干擾素-γ基因特征負相關(guān)。與此同時，在獨立的組織微陣列隊列中，YTHDF1蛋白與CD8⁺ T細胞浸潤呈負相關(guān)，暗示其在TIME中的作用?；蛉笔?em>Ythdf1增強CT26（MSS-CRC）和MC38（MSI-HCRC）同基因腫瘤的抗腫瘤免疫，而在偶氮甲烷-葡聚糖-硫酸鈉或Apc^Min/+模型中，Ythdf1敲入蛋白促進免疫抑制TIME促進結(jié)直腸癌。scRNA-seq發(fā)現(xiàn)，在Ythdf1基因敲除腫瘤中，髓源性抑制細胞（MDSCs）減少，同時細胞毒性T細胞增加。綜合MeRIP-seq、RNA-seq和核糖核酸-seq發(fā)現(xiàn)p65/Rela是YTHDF1的靶標(biāo)。YTHDF1促進p65翻譯上調(diào)CXCL1，從而增加MDSC通過CXCL1-CXCR2軸的遷移。增加的MSDCs反過來在時間上拮抗功能性CD8⁺ T細胞。重要的是，通過CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）或VNPs-siYTHDF1靶向YTHDF1可提高MSI-HCRC的抗PD1療效，并克服MSSCRC的抗PD1耐藥性。YTHDF1通過M⁶A-P65-CXCL1/CXCR2軸損害抗腫瘤免疫，促進結(jié)直腸癌，并在免疫檢查點阻斷治療中作為治療靶點。本文于2023年8月發(fā)表在《Gut》IF:24.5期刊上。
技術(shù)路線

主要實驗結(jié)果
1、YTHDF1與結(jié)直腸癌中IFN-γ相關(guān)基因特征降低和預(yù)后不良相關(guān)
       通過使用TCGA數(shù)據(jù)分析21個已知的m⁶A調(diào)控子的拷貝數(shù)變化，作者鑒定出YTHDF1是m⁶A調(diào)控子在近80%的CRC腫瘤中顯示拷貝數(shù)增加或擴增中最高。這種拷貝數(shù)的增加也與mRNA表達和蛋白表達的上調(diào)相一致，提示YTHDF1具有促進CRC的功能。為建立抗腫瘤免疫與m⁶A調(diào)節(jié)因子之間的聯(lián)系，該研究隨后使用GSEA分析m⁶A調(diào)節(jié)因子與IFN-γ反應(yīng)基因標(biāo)記之間的相關(guān)性。作者發(fā)現(xiàn)YTHDF1與IFN-γ反應(yīng)通路呈顯著負相關(guān)（q<0.0001）。值得注意的是，IFN-γ反應(yīng)與抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)和對ICB治療的反應(yīng)有關(guān)。一致地，YTHDF1的表達與18 IFN-γ相關(guān)的基因標(biāo)記呈強反相關(guān)（圖1A），這預(yù)測多種癌癥類型的抗PD1反應(yīng)性。此外，CD8A或CD8⁺ T細胞特征的表達與YTHDF1表達呈負相關(guān)。與TCGA數(shù)據(jù)一致，來自CRC TMA隊列的TMA IHC染色顯示，隊列I（p<0.001，r= -0.248，n=206）（圖1B）和隊列II（p<0.0001，r= -0.269，n=202）中，YTHDF1蛋白的高表達與CD8⁺ T細胞的低浸潤相關(guān)（圖1C）。這些數(shù)據(jù)強烈暗示，m⁶A閱讀器YTHDF1與抗腫瘤免疫功能受損和ICB治療效果降低有關(guān)。
       與CD8⁺ T細胞浸潤低與預(yù)后不良相關(guān)的觀點一致，YTHDF1高表達（54.3%，100/184）預(yù)測CRC患者生存不良（p<0.01，log-rank檢驗）。多因素Cox回歸分析證實，YTHDF1是隊列II中結(jié)直腸癌的獨立預(yù)后因素（HR，1.764；95%可信區(qū)間1.058-2.939；p<0.05）。在隊列I中，通過多變量Cox回歸分析進一步驗證這些發(fā)現(xiàn)。
2、單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示YTHDF1誘導(dǎo)的免疫抑制
       為研究YTHDF1在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用，作者使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除MC38小鼠MSI-H CRC細胞中的Ythdf1（Ythdf1-KO），并將細胞注射到同基因C57BL6小鼠（圖1D）。發(fā)現(xiàn)與對照組（NC）相比，敲除Ythdf1后，腫瘤體積和重量都減少（圖1E）。為了解Ythdf1-KO是否影響TIME，作者從腫瘤中分離出CD45⁺免疫細胞，并進行單細胞RNA-seq（scRNA-seq）（NC：1480個細胞；Ythdf1-KO：1816個細胞）。與NC組相比，含有Ythdf1-KO的腫瘤表現(xiàn)出粒細胞髓源性抑制細胞（G-MDSCs，簇3）和中性粒細胞的顯著減少（圖1F）。相比之下，Ythdf1-KO腫瘤中T細胞和NK細胞大量增加（圖1F）。作者進一步將T細胞和NK細胞重新聚集為CD4⁺ T、CD8⁺ T、NKT和NK細胞亞群，并發(fā)現(xiàn)與對照組相比，它們在Ythdf1-KO腫瘤中同時增加（圖1F）。因此，作者推測YTHDF1可以通過誘導(dǎo)MDSC積累來抑制抗腫瘤免疫。通過檢測MDSCs的功能標(biāo)記物Il1b、Arg2、Cxcr2和Ccr2，這些基因主要富集于MDSC簇（簇3和簇4），特別是來自未敲除Ythdf1的腫瘤（圖1G）。因此，來自該同基因模型的數(shù)據(jù)支持YTHDF1在結(jié)直腸癌中的免疫抑制功能。

圖1 在免疫功能正常的小鼠中通過scRNA-seq驗證YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（YTHDF1）與結(jié)直腸癌（CRC）患者的免疫抑制微環(huán)境相關(guān)

3、敲除Ythdf1可減少MDSCs，但增加細胞毒性T細胞浸潤
       為驗證在scRNA-seq分析中的發(fā)現(xiàn)，作者用流式細胞術(shù)測定MC38同基因小鼠腫瘤浸潤免疫細胞的組成，證實敲除Ythdf1顯著抑制腫瘤的重量和體積（圖1C）。并且流式細胞術(shù)顯示，敲除Ythdf1減少MDSCs，但增加腫瘤中的CD8⁺ T和CD4⁺ T細胞（圖1H，I）。在MDSCs中，G-MDSCs是主要的亞群，敲除Ythdf1導(dǎo)致G-MDSCs顯著減少（圖1I）。與MDSCs的免疫抑制功能一致，作者觀察到Ythdf1-KO組功能T細胞顯著增加，包括IFN-γ⁺ CD8⁺ T細胞、顆粒酶B⁺ CD8⁺ T細胞和IFN-γ⁺ CD4⁺ T細胞（圖1H，J）。
       接下來，作者在CT26（MSS-CRC）中與Ythdf1-KO進行實驗，以驗證YTHDF1在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用。正如預(yù)期的那樣，Ythdf1-KO導(dǎo)致CT26同基因小鼠腫瘤體積和重量減?。▓D2A，B），同時功能T細胞減少和MDSCs積累（圖2C，D）。免疫熒光染色證實，Ythdf1基因敲除后，MC38和CT26同基因腫瘤中MDSCs（CD11b⁺ Gr-1⁺）的浸潤減少（圖2E）?？偟膩碚f，結(jié)直腸癌細胞中Ythdf1的缺失減少MDSCs，增加功能性T細胞的浸潤。這些發(fā)現(xiàn)與臨床數(shù)據(jù)一致，顯示YTHDF1與CD8⁺ T細胞和IFN-γ相關(guān)的特征（圖1A-C）。
       作者想知道在Ythdf1-KO中減弱的腫瘤形成是否依賴于CD8⁺ T細胞抗腫瘤免疫。為解決這個問題，作者在MC38同基因模型中使用抗CD8抗體去除CD8⁺ T細胞。與假設(shè)一致，CD8⁺ T細胞的消耗恢復(fù)Ythdf1-KO腫瘤的生長（圖2F，G），表明Ythdf1-KO的腫瘤抑制功能至少部分依賴于CD8⁺ T細胞。這在CT26同基因小鼠中得到證實，表明抗CD8抗體治療可以挽救Ythdf1-KO組中被抑制的腫瘤生長（圖2H，I）。總之，Ythdf1敲除通過誘導(dǎo)CD8⁺ T細胞依賴性抗腫瘤免疫抑制結(jié)直腸癌的生長。

圖2 YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（Ythdf1）敲除通過減少髓源性抑制細胞（MDSC）和增加同源腫瘤中的功能性T細胞來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，這種作用被CD8⁺ T細胞消耗逆轉(zhuǎn)

4、腸道特異性Ythdf1敲入促進小鼠結(jié)直腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫
       為驗證YTHDF1在自發(fā)性結(jié)直腸腫瘤發(fā)生中的作用，作者構(gòu)建腸道特異性的Ythdf1敲入小鼠（Ythdf1^loxp/loxp CDX2-cre），并通過AOM/DSS治療在這些小鼠中啟動CRC（圖3A），發(fā)現(xiàn)在AOM/DSS模型中，Ythdf1的過表達導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤數(shù)量和大小增加（圖3C）。流式細胞術(shù)顯示，與野生型小鼠相比，Ythdf1敲入小鼠結(jié)腸腫瘤中MDSC浸潤增加，NK、CD4⁺ T和CD8⁺ T細胞減少（圖3D）。此外，作者發(fā)現(xiàn)，通過檢測顆粒酶B、INF-γ和TNF-α的表達，Ythdf1敲入降低功能性T細胞的比例（圖3E）。
       接下來，作者通過建立Apc^Min/+ Ythdf1^loxp/loxp CDX2-cre小鼠，試圖在Apc^Min/+驅(qū)動的自發(fā)性CRC中驗證這些結(jié)果（圖3B）。與此一致的是，腸道特異性敲入Ythdf1的Apc^Min/+小鼠的結(jié)腸腫瘤明顯大于野生型小鼠（圖3C）。腫瘤浸潤性免疫細胞分析發(fā)現(xiàn)Apc^Min/+敲入Ythdf1后，腫瘤中NK、CD4⁺ T和CD8⁺ T細胞的浸潤顯著減少，同時MDSCs誘導(dǎo)增加（圖3F）。此外，Ythdf1敲入降低Apc^Min/+小鼠的顆粒酶B⁺、INF-γ⁺或TNF-α⁺ T細胞（圖3G）?？傊@些結(jié)果支持YTHDF1培養(yǎng)促進自發(fā)性CRC的免疫抑制微環(huán)境。

圖3 腸道特異性YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（Ythdf1）敲入促進小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫。

5、通過VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1增強CD34⁺人源化小鼠的抗腫瘤免疫
       為證實YTHDF1在調(diào)節(jié)人抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用，作者建立CD34⁺人源化小鼠模型小鼠外周血單個核細胞（PBMCs）含有>20%的人CD45⁺細胞（圖4A）。為在體內(nèi)靶向YTHDF1，作者開發(fā)VNPs來攜帶針對YTHDF1的siRNA。在腫瘤達到50-100 mm³后，攜帶人結(jié)直腸癌HCT116異種移植物的人源化NSG小鼠接受VNP-siNC或-siYTHDF1治療（圖4B）。與VNP-siNC相比，VNP-siYTHDF1顯著抑制腫瘤體積和重量（圖4B，C）。進行流式細胞術(shù)分析TIME（圖4D）。VNP-siYTHDF1減少MDSC浸潤，但增加CD4⁺ T細胞、CD8⁺ T細胞和NK細胞積聚（圖4E）。此外，在接受VNP-siYTHDF1的腫瘤中發(fā)現(xiàn)更多的IFN-γ⁺、TNF-α⁺和顆粒酶B⁺ CD8⁺ T細胞（圖4E）。因此，利用VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1是增強人源化小鼠抗腫瘤免疫的一種安全有效的手段。

圖4 VNP-siYTHDF1增強CD34⁺人源化小鼠的抗腫瘤免疫

6、YTHDF1促進p65翻譯激活TNF/NF-κB信號傳導(dǎo)
       為確定YTHDF1引發(fā)免疫抑制的分子機制，作者在敲除或不敲除YTHDF1的CRC細胞中進行Ribo-seq。Ribo-seq數(shù)據(jù)顯示，YTHDF1的缺失與TNF信號的失活顯著相關(guān)（圖5A）。因此，YTHDF1敲除減少參與TNF信號傳導(dǎo)的核糖體保護片段基因豐度（圖5A）。因此，YTHDF1可以通過促進蛋白翻譯調(diào)節(jié)TNF/NF-κB信號傳導(dǎo)。由于YTHDF1具有m⁶A閱讀器的功能，作者接下來進行m⁶A免疫沉淀測序（MeRIP-seq）以確定m⁶A修飾的轉(zhuǎn)錄本。通過篩選參與TNF信號傳導(dǎo)的mRNA中的m⁶A峰，作者確定兩個靠近p65 mRNA終止密碼子的m⁶A位點（圖5B），并通過MeRIP-qPCR驗證這一點（圖5C）。重要的是，通過RNA免疫沉淀（RIP）測序和抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)YTHDF1和p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5D）。因此，p65 mRNA是YTHDF1的直接靶點。作者發(fā)現(xiàn)在CT26和MC38細胞中，敲除Ythdf1降低p65蛋白的表達，尤其是核p65的表達，而不影響NF-κB通路的其他調(diào)節(jié)因子如IKKα和iκBα的表達（圖5E）。在人類結(jié)直腸癌細胞中獲得一致的結(jié)果，顯示野生型YTHDF1過表達，而非功能失調(diào)突變體，p65蛋白表達升高；相反，YTHDF1敲低會減弱人類結(jié)直腸癌細胞中的p65蛋白（圖5F）。使用抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR也證實人結(jié)直腸癌細胞中YTHDF1與p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5G）。接下來，作者試圖在體內(nèi)驗證YTHDF1和p65的關(guān)聯(lián)。在敲入Ythdf1的小鼠中，結(jié)腸腫瘤中的p65和phospho-p65蛋白均升高（圖5H）?？傊琘THDF1促進p65蛋白的表達，在體外和體內(nèi)激活TNF和NF-κB信號。

圖5 YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（YTHDF1）通過促進RELA （p65） mRNA翻譯促進CRC中TNF/NF-kB信號傳導(dǎo)

7、YTHDF1通過p65-CXCL1軸促進MDSC遷移
       為了解YTHDF1誘導(dǎo)的p65與其免疫抑制之間的聯(lián)系，作者在CRC細胞、腫瘤裂解物和同源腫瘤小鼠血清的條件培養(yǎng)基中進行細胞因子多重免疫測定，檢測23種不同的小鼠細胞因子。在這些細胞因子中，Ythdf1-KO持續(xù)降低CXCL1（圖6A），并且通過ELISA檢測證實CXCL1的這種降低（圖6B）。據(jù)報道，CXCL1是NF-κB信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄靶點，它通過與其受體CXCR2的相互作用促進MDSC趨化。鑒于Ythdf1-KO在CRC TIME減少MDSC的浸潤，作者想知道YTHDF1是否調(diào)節(jié)MDSC的遷移。因此，作者進行MDSC體外遷移實驗，發(fā)現(xiàn)來自野生型CRC細胞的條件培養(yǎng)基增強MDSC的遷移，而這種遷移被Ythdf1的敲除所破壞（圖6C）。通過CXCR2抑制劑SB265610阻斷CXCL1-CXCR2相互作用，消除對照組和Ythdf1-KO培養(yǎng)上清在介導(dǎo)MDSC遷移方面的差異（圖6C）。因此，YTHDF1通過CXCL1/CXCR2軸促進MDSC遷移。接下來，作者想知道YTHDF1是否可以調(diào)節(jié)Cxcl1 mRNA的表達。正如預(yù)期的那樣，敲除Ythdf1顯著抑制小鼠（圖6D）和人CRC細胞系中Cxcl1 mRNA的水平。因此，研究結(jié)果支持YTHDF1-p65-CXCL1/CXCR2軸介導(dǎo)CRC中MDSC的遷移。
       接下來，作者研究YTHDF1是否影響MDSC功能。從MC38同基因腫瘤中分離CD11b⁺ Gr-1⁺ MDSCs，然后與T細胞體外共培養(yǎng)（圖6E）。從對照腫瘤中分離的MDSCs抑制T細胞增殖；然而，與來自對照組的MDSCs相比，來自Ythdf1-KO腫瘤的MDSCs對CD8⁺ T細胞和CD4⁺ T細胞的增殖抑制活性明顯降低（圖6F，G）。這些數(shù)據(jù)驗證MDSCs對關(guān)鍵效應(yīng)細胞（包括CD8⁺ T細胞和CD4⁺ T細胞）的免疫抑制功能，并支持表達YTHDF1的CRC招募功能性MDSCs。

圖6 YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（Ythdf1）的缺失通過減少CXCL1的分泌來促進髓源性抑制細胞（MDSCs）的減少。

8、YTHDF1是CRC免疫治療的潛在治療靶點
       考慮到MDSCs浸潤減少已被報道與各種癌癥類型的免疫治療效果增強相關(guān)，作者試圖測試靶向YTHDF1是否能增強CRC的抗PD1治療。正如預(yù)期的那樣，作者發(fā)現(xiàn)敲除Ythdf1增強MC38 （MSI-H）同基因腫瘤中抗PD1的功效，延長荷瘤小鼠的生存期（圖7A）。作者進一步利用VNPs系統(tǒng)將特異性Ythdf1-siRNA傳遞到腫瘤中。當(dāng)MC38同基因腫瘤達到50~100 mm³時，作者用VNP-siYthdf1（或VNP-siNC）和抗PD1（或IgG）治療小鼠。與VNP-siNC相比，VNP-siYthdf1顯著抑制MC38腫瘤生長（圖7B，C）。值得注意的是，VNP-siYthdf1與anti-PD1聯(lián)合使用對腫瘤生長的抑制作用最強（圖7B,C）。
       基于同基因CT26（MSS CRC）腫瘤模型，作者進一步研究靶向YTHDF1是否可以克服MSS CRC的抗PD1耐藥性。因此，將敲除Ythdf1的CT26細胞注射到同基因小鼠體內(nèi)，并用PD1抗體處理，發(fā)現(xiàn)敲除Ythdf1顯著增強CT26同基因腫瘤的抗PD1治療效果，否則這些腫瘤對ICB治療無反應(yīng)（圖7D，E）。
       流式細胞術(shù)分析進一步顯示，在CT26和MC38同基因模型中，Ythdf1沉默和抗PD1聯(lián)合使用可顯著增加腫瘤浸潤的功能性CD8⁺ T細胞，包括IFN-γ⁺ CD8⁺ T細胞和顆粒酶B⁺ CD8⁺ T細胞（圖7F，G）。此外，聯(lián)合治療顯著減少MDSCs的積累，同時誘導(dǎo)CD4⁺ T細胞和CD8⁺ T細胞（圖7G）。因此，靶向YTHDF1不僅可以增強ICB在MSI-H型CRC中的治療效果，還可以通過抑制MDSCs的募集和改善CD8⁺ T細胞的功能來克服MSS型CRC中的ICB耐藥性。
       在這里，作者發(fā)現(xiàn)在癌細胞中消耗Ythdf1會抑制腫瘤內(nèi)的MDSCs，并減輕MDSCs對效應(yīng)細胞的免疫抑制功能。MDSCs和T細胞共培養(yǎng)研究表明，與對照腫瘤相比，來自Ythdf1-KO腫瘤的MDSCs抑制CD8+ T細胞和CD4+ T細胞增殖的能力受損。因此，研究結(jié)果支持YTHDF1介導(dǎo)功能性MSDCs的募集，這抑制CRC中效應(yīng)T細胞的功能和增殖，導(dǎo)致免疫監(jiān)視功能受損（圖7H）。

圖7 靶向YTH N⁶-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（YTHDF1）增強抗PD1阻斷治療在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（MSI-H）和微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌（CRC）中的應(yīng)用

       綜上所述，YTHDF1在結(jié)直腸癌中的表達通過激活m6 A-p65-CXCL1軸募集免疫抑制性MDSCs抑制T細胞，從而促進結(jié)直腸癌的發(fā)生。靶向YTHDF1加抗PD1治療對結(jié)直腸癌有良好的抗腫瘤療效，證實YTHDF1是結(jié)直腸癌的潛在治療靶點。

實驗方法
人源化小鼠模型，TCGA數(shù)據(jù)分析，CRISPR/Cas9敲除，穩(wěn)定細胞系過表達，同基因小鼠模型，RT-qPCR，免疫組織化學(xué)，免疫熒光，Western blot，酶聯(lián)免疫測定（ELISA），RNA干擾，囊泡樣plga基納米顆粒(VNP)配方，流式細胞術(shù)分析，單細胞RNA測序，MDSC分離及遷移試驗，細胞因子多重免疫測定，核糖體測序，MeRIP測序和MeRIP-qPCR，RIP-測序或RIP-qPCR，肝腎功能指標(biāo)測定
參考文獻
Bao Y, Zhai J, Chen H, et al. Targeting m⁶A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer. Gut. 2023; 72 (8): 1497-1509. doi: 10.1136/gutjnl-2022-328845