缺乏長壽基因會加重骨關(guān)節(jié)炎？！

       高度保守的依賴NAD⁺的sirtuin脫乙酰酶和單-ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶家族(sirtuins 1-7)是關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，在各種模式生物中控制與年齡相關(guān)的細(xì)胞信號通路并延長壽命。自從發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)Sirt6的整體缺失導(dǎo)致孕激素表型、代謝障礙和出生4周內(nèi)死亡以來，闡明核局部sirtuin 6（SIRT6）在衰老和疾病中的確切作用的努力已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。相反，在雄性和雌性小鼠中，Sirt6的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)控制衰老過程中的代謝信號事件，從而延長壽命。一些證據(jù)表明，Sirt6調(diào)節(jié)一系列與年齡相關(guān)的生物過程，包括DNA修復(fù)、細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激、炎癥、自噬和衰老。
       年齡和關(guān)節(jié)損傷是骨關(guān)節(jié)炎（OA）的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素，骨關(guān)節(jié)炎是最常見的關(guān)節(jié)疾病，也是老年人殘疾的主要原因。在軟骨細(xì)胞中，年齡相關(guān)或損傷相關(guān)的改變有利于分解代謝而不利于合成代謝的信號事件，這促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的丟失，并被認(rèn)為是OA發(fā)展和進(jìn)展中驅(qū)動(dòng)軟骨降解的原因。最近的證據(jù)表明，SIRT6可能是這些過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。例如，體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，SIRT6過表達(dá)降低了人軟骨細(xì)胞的復(fù)制衰老、基質(zhì)金屬蛋白酶-13水平和核因子-kappaB（nf-?B）調(diào)控的基因表達(dá)，而SIRT6缺失則增加了軟骨細(xì)胞中DNA損傷和端粒功能障礙誘導(dǎo)的病灶的標(biāo)志物，并顯著抑制了軟骨肉瘤SW1353細(xì)胞系中COL2A1和ACAN基因的表達(dá)。在小鼠體內(nèi)的數(shù)據(jù)表明，Sirt6單倍體功能不全會增加軟骨蛋白多糖丟失和膝下脂肪墊細(xì)胞因子水平，導(dǎo)致高脂飲食的中年小鼠的國際骨性關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會（OARSI）得分更高。此外，在膠原誘導(dǎo)和K/BxN血清轉(zhuǎn)移的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中，小鼠骨髓特異性Sirt6缺陷已被證明可增加關(guān)節(jié)炎癥和對前分解代謝FOXO1信號事件的敏感性，從而增強(qiáng)關(guān)節(jié)炎癥。相反，在接受內(nèi)側(cè)半月板去穩(wěn)定(DMM)手術(shù)的年輕小鼠中，關(guān)節(jié)內(nèi)給予腺相關(guān)病毒或慢病毒SIRT6，以增加關(guān)節(jié)間隙內(nèi)的SIRT6水平，提供對軟骨損傷的保護(hù)。
       我們以前在原代人軟骨細(xì)胞中的研究表明，SIRT6的激活通過增加抗氧化蛋白水平、降低促氧化劑TXNIP水平和快速解毒核產(chǎn)生的H₂O₂來促進(jìn)對氧化應(yīng)激的抗性。此外，激活SIRT6顯著減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的分解代謝NF-?B信號事件，這些事件與軟骨細(xì)胞死亡和骨關(guān)節(jié)炎有關(guān)。重要的是，我們的報(bào)告還顯示，在人類關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，軟骨細(xì)胞SIRT6活性隨著年齡的增長而顯著下降。然而，關(guān)節(jié)內(nèi)SIRT6缺乏的影響，以及這如何導(dǎo)致體內(nèi)軟骨損傷和骨關(guān)節(jié)炎，在很大程度上仍未被研究。由于先前研究Sirt6體內(nèi)作用的研究使用了少量實(shí)驗(yàn)小鼠（n = 4–6），本研究的目的是全面確定Sirt6缺乏對OA的影響。由于損傷和年齡是OA的兩個(gè)主要危險(xiǎn)因素，我們研究了Sirt6缺乏對年輕小鼠的影響，以內(nèi)側(cè)半月板手術(shù)作為創(chuàng)傷后OA的模型，并評估了中年（12個(gè)月齡）和老年（18個(gè)月齡）小鼠自發(fā)、自然發(fā)生的OA的嚴(yán)重程度。SIRT6調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞功能以保護(hù)軟骨免受OA侵襲的具體機(jī)制在這些小鼠中以及在體外使用原代人軟骨細(xì)胞進(jìn)行了檢測。本文于2023年8月發(fā)表于《TRANSLATIONAL SCIENCE》IF=27.4期刊上。
技術(shù)路線

主要結(jié)果

1.軟骨特異性Sirt6缺乏增加DMM誘導(dǎo)的小鼠骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度

       因?yàn)樾∈?em>Sirt6的整體缺失導(dǎo)致4周齡內(nèi)死亡，我們建立了可誘導(dǎo)的軟骨特異性Sirt6缺陷小鼠（Sirt6^fl/fl；Aggrecan-Cre^ERT2，（Sirt6 cKO）），并將它們與Sirt6完整的同窩對照組（Sirt6^fl/fl）進(jìn)行比較。Sirt6完整和Sirt6缺陷小鼠在16周齡時(shí)接受DMM手術(shù)或假手術(shù)，并在術(shù)后6周和10周通過組織學(xué)、詳細(xì)的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和顯微CT分析OA的嚴(yán)重程度。在組織學(xué)上，接受DMM手術(shù)的Sirt6完整和Sirt6缺陷小鼠都出現(xiàn)了OA的癥狀，其特征是在研究的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與假對照組相比，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)（ACS）、Toloniumchloride、骨贅和滑膜增生評分顯著增加（圖1A-D）。當(dāng)比較DMM組（Sirt6完整與Sirt6 cKO）時(shí)，與術(shù)后6周和10周Sirt6完整小鼠相比，Sirt6缺陷小鼠的ACS、Toloniumchloride和骨贅評分明顯更高（更差）（圖1A-D）。
       與我們的組織學(xué)數(shù)據(jù)一致的是，對脛骨平臺內(nèi)側(cè)和外側(cè)的詳細(xì)組織形態(tài)學(xué)分析表明，接受假手術(shù)的小鼠幾乎沒有顯示出OA的跡象，而DMM手術(shù)在所研究的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都產(chǎn)生了OA表型，這由顯著的軟骨損失以及在某些情況下鈣化軟骨的損失和軟骨下骨板（SCBP）面積和厚度的增加所證明（表1和2）。手術(shù)后6周，與接受DMM手術(shù)的Sirt6完整小鼠相比，接受DMM手術(shù)的Sirt6缺陷小鼠的關(guān)節(jié)軟骨面積和厚度顯著減少（表1）。在第10周時(shí)，這種OA表型惡化，并且與經(jīng)歷DMM的Sirt6完整小鼠相比，軟骨特異性Sirt6缺乏的小鼠也表現(xiàn)出鈣化軟骨厚度的顯著減少和SCBP面積和厚度的增加（表2）。
       微型CT分析脛骨軟骨下骨體積分?jǐn)?shù)（Bv/Tv）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁間距（Tb.Sp）和軟骨下骨板厚度（SCBP）。在所有小鼠的脛骨內(nèi)側(cè)平臺上進(jìn)行Th。在手術(shù)后6周，接受DMM手術(shù)的Sirt6基因缺陷小鼠的BV/Tv和Tb.Th顯著增加，Tb.Sp值顯著降低，這表明與接受假手術(shù)的SIRT6基因缺陷小鼠相比，這組小鼠的骨硬化程度增強(qiáng)（圖1E和G）。在這一時(shí)間點(diǎn)，來自兩個(gè)手術(shù)組的Sirt6完整小鼠之間沒有觀察到任何變化。術(shù)后10周，與假手術(shù)組相比，兩個(gè)DMM組的BV/Tv和Tb.Th均增加，Tb.Sp顯著降低，表明DMM在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)了骨硬化（圖1F和H）。在分析DMM組之間的差異時(shí)，Sirt6缺陷小鼠與Sirt6完整小鼠相比，BV/Tv和Tb.Th顯著增加，Tb.Sp減少，這表明在沒有Sirt6的情況下骨硬化增強(qiáng)（圖1F和H）。接受DMM手術(shù)的Sirt6缺陷小鼠的骨贅面積和骨贅體積也顯著大于Sirt6完整小鼠（圖1I，J），這與我們的組織學(xué)骨贅評分一致?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，小鼠軟骨中Sirt6缺乏增加了DMM誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。

圖1 Sirt6缺乏對DMM術(shù)后骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的影響

表1 DMM術(shù)后6周Sirt6完整和Sirt6缺陷（Sirt6 CKO）小鼠接受DMM或Sham手術(shù)的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

表2 DMM術(shù)后10周Sirt6完整和Sirt6缺陷（Sirt6 CKO）小鼠接受DMM或Sham手術(shù)的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

2.軟骨特異性Sirt6缺乏加速小鼠自發(fā)的年齡相關(guān)性骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度

       為了評估Sirt6缺乏對自發(fā)、自然發(fā)生的骨性關(guān)節(jié)炎的影響，對12個(gè)月和18個(gè)月齡的Sirt6完整和Sirt6缺乏的小鼠進(jìn)行了骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度分析，根據(jù)DMM研究。在12個(gè)月大時(shí)，與Sirt6完整對照組相比，Sirt6缺陷小鼠的ACS、Toloniumchloride和骨贅總分顯著增加（圖2A，B）。一致的是，詳細(xì)的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析顯示，與Sirt6完整的對照組相比，Sirt6缺陷小鼠的內(nèi)側(cè)和外側(cè)關(guān)節(jié)軟骨面積和鈣化軟骨面積都顯著減少（表3和4）。在小鼠18個(gè)月時(shí)，兩種基因型都表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨性關(guān)節(jié)炎，在脛骨平臺內(nèi)側(cè)有明顯的軟骨丟失，但兩種基因型之間沒有顯著差異（圖2，表3）。在外側(cè)，18個(gè)月齡的Sirt6缺陷小鼠的關(guān)節(jié)軟骨面積和厚度與Sirt6正常對照相比顯著減少（表4）。在這項(xiàng)老齡研究中，年齡或基因?qū)ぴ錾鷽]有影響（圖2B）。同樣，當(dāng)我們在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析來自兩個(gè)基因型的四肢時(shí)，我們沒有通過Micro-CT檢測到軟骨下骨參數(shù)（內(nèi)側(cè)）的任何顯著差異（圖2E，F(xiàn)）?；ぴ錾蛙浌窍鹿歉淖儾皇苣挲g的影響，這一發(fā)現(xiàn)與我們之前在類似時(shí)間點(diǎn)評估這些參數(shù)的小鼠研究一致。對18月齡Sirt6完整小鼠和Sirt6基因缺陷小鼠的關(guān)節(jié)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，以檢測作為衰老標(biāo)志的p16^ink4a。與正常對照組相比，Sirt6基因缺陷小鼠滑膜中p16^ink4a陽性細(xì)胞顯著增加（p=0.0031）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，軟骨特異性Sirt6缺乏顯著加速了小鼠自發(fā)的、與年齡相關(guān)的骨性關(guān)節(jié)炎。
       有趣的是，當(dāng)分析6個(gè)月大的DMM組（假手術(shù)后10周）的對照小鼠肢體，并將它們與12個(gè)月和18個(gè)月大的完整Sirt6對照進(jìn)行比較時(shí)，我們觀察到BV/Tv和Tb.Th值增加，而Tb.Sp值在老年小鼠肢體中降低。這一發(fā)現(xiàn)表明，小鼠的衰老本身就會增加軟骨下骨硬化癥，據(jù)我們所知，這是一個(gè)原創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)。

圖2 SIRT6缺乏對衰老過程中骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的影響

表3 12月齡和18月齡Sirt6完整和Sirt6缺陷（Sirt6 CKO）小鼠（脛骨內(nèi)側(cè)平臺）的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

表4 Sirt6完整和Sirt6缺陷（Sirt6 CKO）小鼠12月齡和18月齡（脛骨外側(cè)平臺）的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

3.Sirt6缺陷與人軟骨細(xì)胞ECM和生長因子基因下調(diào)有關(guān)

       為了確定Sirt6介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，對缺失Sirt6的原代人軟骨細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序，并與干擾的小干擾RNA（SiRNA）對照細(xì)胞（72小時(shí)）進(jìn)行了比較。初步研究證實(shí)SIRT6 siRNA缺失，并證明與對照組相比，SIRT6 siRNA的核導(dǎo)入導(dǎo)致SIRT6蛋白水平顯著降低（p=<0.0001）。在我們的RNA測序數(shù)據(jù)集中，主成分分析表明，按治療方法分組。SIRT6缺失的樣本與對照組的比較顯示，236個(gè)基因差異表達(dá)，其中160個(gè)基因下調(diào)，76個(gè)基因上調(diào)（圖3A）。分析表明，軟骨細(xì)胞SIRT6的缺失預(yù)計(jì)會增加關(guān)節(jié)炎癥、軟骨損傷和OA疾病的進(jìn)程?；虮倔w論濃縮分析表明，與對照組相比，細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白質(zhì)類細(xì)胞外基質(zhì)（細(xì)胞成分）和生長因子活性（分子功能）術(shù)語是缺失SIRT6的人軟骨細(xì)胞中最受抑制的三個(gè)過程（圖3B）。
       對差異表達(dá)的ECM基因的查詢顯示，在關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)的主要膠原COL2A1在SIRT6缺失的細(xì)胞中與其他ECM基因如COMP、ECM2、CILP2和COL8A1一起顯著減少。qRT-PCR法顯示，與對照組相比，SIRT6缺陷軟骨細(xì)胞中COL2A1（p=0.0008）和comp（p=0.0001）基因的表達(dá)顯著降低（圖3C）。在生長因子抑制的背景下，促合成胰島素樣生長因子-1（IGF1；p=0.0070，IGFBP2；p=0.0011）在SIRT6缺失的軟骨細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)（IGF1；p=0.0070，IGFBP2；p=0.0011）。上游調(diào)控分析表明，IGF-1的下調(diào)預(yù)計(jì)會抑制我們數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的各種促合成軟骨基因，包括COL2A1和IGFBP2（圖3D）。在核糖核酸測序數(shù)據(jù)集中其他顯著下調(diào)的基因包括Sirt6（p=0.0011），Wnt抑制物SFRP1（p=0.0048）和SFRP4（p=0.0002），以及著名的SIRT6調(diào)節(jié)的代謝和壽命調(diào)節(jié)因子PCK1（p=0.005）（圖3C）。相反，缺乏SIRT6導(dǎo)致促進(jìn)分解代謝的IL1RL1和HHIP基因顯著增加，當(dāng)增強(qiáng)時(shí)，這兩個(gè)基因與OA的進(jìn)展和發(fā)展有關(guān)。這些效應(yīng)也通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（IL1RL1；p=0.0121，HHIP；p=0.0008）得到驗(yàn)證（圖3A和C）。
       綜上所述，這些結(jié)果表明，SIRT6的缺失顯著降低了IGF-1基因和包括COL2A1在內(nèi)的一系列ECM基質(zhì)基因的表達(dá)，并促進(jìn)了與OA相關(guān)的促分解代謝基因的基因表達(dá)。由于IGF-1信號在維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨細(xì)胞存活中起著關(guān)鍵作用，這些結(jié)果促使我們進(jìn)一步探索SIRT6/IGF-1軸在軟骨細(xì)胞中的作用。

圖3 Sirt6缺失的人軟骨細(xì)胞的RNA測序分析

4.SIRT6對人軟骨細(xì)胞中IGF-1信號的調(diào)控

       為了評估Sirt6缺陷對IGF-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，本研究對Sirt6完整和Sirt6缺陷小鼠的股骨頭軟骨進(jìn)行了解剖和體外培養(yǎng)。用4-羥基他莫昔芬處理外泌體96小時(shí)，以誘導(dǎo)Cre介導(dǎo)的Sirt6缺失，然后提取軟骨細(xì)胞并進(jìn)行免疫印跡處理，以檢測IGFBP2和磷酸化的Akt，作為IGF-1信號通路激活的標(biāo)志。與Sirt6完整的股骨頭外植體相比，缺失Sirt6的外植體顯示基礎(chǔ)IGFBP2（p=0.0112）和磷酸化Akt^ser473（p=0.0229）蛋白水平顯著降低（圖4A）。對來自我們的數(shù)字MM研究中的Sirt6完整和Sirt6缺失的假對照組小鼠的關(guān)節(jié)組織切片進(jìn)行的免疫組化研究表明，與Sirt6完整的對照組相比，Sirt6缺陷的小鼠軟骨中胰島素樣生長因子-1的水平顯著降低（p=0.0002），這與我們在Sirt6基因敲除的人軟骨細(xì)胞中的RNA測序數(shù)據(jù)一致（圖4B）。
       由于Sirt6缺乏降低了小鼠軟骨中的IGF-1/Akt軸，我們接下來的目標(biāo)是測試SIRT6激活對軟骨細(xì)胞中IGF-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。用編碼SIRT6的腺病毒載體（24小時(shí)）轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人軟骨細(xì)胞以增加SIRT6的活性，或如前所述的空載體（空）對照。與空載體對照相比，SIRT6過表達(dá)顯著增加了Akt在Ser⁴⁷³（p=0.0178）和Thr³⁰⁸（p=0.0003）處的基礎(chǔ)磷酸化，并增加了Akt活性的標(biāo)志--富含Pro的Akt底物的磷酸化（p=0.0249）（圖4C）。接下來，我們用SIRT6的小分子激活劑MDL800處理原代人類軟骨細(xì)胞，此前已有研究表明，它可以將SIRT6的活性提高22倍。我們分離了軟骨細(xì)胞組蛋白，并對SIRT6底物的乙酰化形式H3K9（H3K9ac）進(jìn)行了免疫印跡，H3K9ac是SIRT6活性的反向標(biāo)記。用MDL-800（12.5微米，24小時(shí)）處理軟骨細(xì)胞后，H3K9的基礎(chǔ)乙?；问斤@著減少（p=0.0001），表明與對照組相比，SIRT6活性增強(qiáng)。在總細(xì)胞裂解物中，MDL800誘導(dǎo)的SIRT6激活導(dǎo)致基礎(chǔ)磷酸化Akt^ser473和磷酸化PRAS40顯著增加，并在處理3小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值（分別為p=0.0170，p=0.0120）（圖4D）。在研究的時(shí)間過程中，SIRT6蛋白水平?jīng)]有隨著MDL-800的處理而改變，這與其他研究結(jié)果一致?？傊?，這些功能獲得和功能喪失的研究表明，SIRT6是小鼠和人類軟骨細(xì)胞中促合成代謝的IGF-1信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并減少與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的分解代謝信號事件。

圖4 SIRT6調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中的胰島素樣生長因子-1（IGF-1）信號

實(shí)驗(yàn)方法
H&E染色、免疫印跡、RT-qPCR
參考文獻(xiàn)
Collins, J. A. et al. Cartilage-specificSirt6deficiency represses IGF-1 and enhances osteoarthritis severity in mice. Annals of the Rheumatic Diseases, 2023 doi:10.1136/ard-2023-224385 (2023).