LncRNA EILA通過穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白E1促進(jìn)乳腺癌對(duì)CDK4/6抑制劑耐藥
由異常細(xì)胞周期進(jìn)程驅(qū)動(dòng)的不受控細(xì)胞增殖是癌癥最重要的標(biāo)志之一。因此，尋求藥物來阻滯細(xì)胞周期和停止細(xì)胞增殖是癌癥治療的一種合理方式。細(xì)胞周期受細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）及其伴侶細(xì)胞周期蛋白的精確調(diào)控。從而使S期進(jìn)入和DNA復(fù)制成為可能。使用CDK4/6抑制劑（CDK4/6i）靶向CDK4和CDK6將細(xì)胞周期阻滯在G1期，并阻礙細(xì)胞增殖。三種CDK4/6抑制劑延長了晚期激素受體陽性和人表皮生長因子受體2陰性乳腺癌患者的無進(jìn)展生存期和總生存期。因此，CDK4/6抑制劑聯(lián)合內(nèi)分泌治療已成為這類乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而，對(duì)CDK4/6抑制劑的耐藥不可避免，超過70%的患者在12~36個(gè)月內(nèi)發(fā)生疾病進(jìn)展，這帶來了巨大的臨床挑戰(zhàn)。CDK4/6i耐藥的主要機(jī)制包括上游致癌信號(hào)的異常激活和關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的改變。由CCNE1基因編碼的細(xì)胞周期蛋白E1激活CDK2并促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展。cyclin E1的高表達(dá)不僅預(yù)示著乳腺癌患者的不良預(yù)后，而且在臨床前模型中還促進(jìn)了對(duì)內(nèi)分泌治療和CDK4/6抑制劑的耐藥。cyclin E1蛋白可能在CDK4/6i耐藥中起關(guān)鍵作用，直接靶向cyclin E1蛋白可能是克服CDK4/6i耐藥的有效途徑。之前的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA DILA1通過穩(wěn)定cyclin D1蛋白促進(jìn)乳腺癌他莫昔芬耐藥，揭示了lncRNA在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用。然而，lncRNA在CDK4/6i耐藥中的作用仍不清楚。該研究發(fā)表在《Science Advances》，IF：13.6。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. Cyclin E1失調(diào)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)CDK4/6抑制劑的耐藥
建立CDK4/6i耐藥乳腺癌細(xì)胞（MCF7-palR和T47D-palR細(xì)胞）。為了探索cyclin E1在CDK4/6i耐藥細(xì)胞中的作用，研究者首先評(píng)估了其在耐藥細(xì)胞及其親本細(xì)胞中的mRNA和蛋白水平。研究者發(fā)現(xiàn)，在MCF7-palR和T47D-palR細(xì)胞中，cyclin E1的蛋白水平上調(diào)，而其mRNA水平保持不變（圖1A）。此外，細(xì)胞周期蛋白E1蛋白在耐藥細(xì)胞中比在其親本細(xì)胞中更穩(wěn)定（圖1B）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞周期蛋白E1在翻譯后水平失調(diào)。為了確定細(xì)胞周期蛋白E1表達(dá)增加是否有助于CDK4/6i耐藥，研究者在耐藥乳腺癌細(xì)胞中使用特異性小干擾RNA（siRNA）沉默細(xì)胞周期蛋白E1，并利用甲基噻唑基二苯基四唑溴鹽試驗(yàn)評(píng)估其對(duì)哌柏西利的敏感性。正如預(yù)期，研究者發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白E1敲低恢復(fù)了MCF7-palR和T47D-palR細(xì)胞對(duì)哌柏西利的敏感性（圖1C）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞周期蛋白E1蛋白的失調(diào)是導(dǎo)致CDK4/6i抵抗的原因。
圖1 CDK4/6i耐藥的乳腺癌細(xì)胞表達(dá)更高水平的cyclin E1蛋白和cyclin E1相互作用的lncRNA EILA
2. EILA是與細(xì)胞周期蛋白e1相互作用的長鏈非編碼RNA
為了鑒定可能與cyclin E1蛋白相互作用并促進(jìn)CDK4/6i耐藥的lncRNA，研究者進(jìn)行了兩個(gè)高通量lncRNA測(cè)序。用血凝素（HA）抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)，將穩(wěn)定表達(dá)HA標(biāo)記的cyclin E1的MCF7-pa細(xì)胞中的RNA進(jìn)行測(cè)序。以免疫球蛋白G作為對(duì)照，研究者鑒定了52個(gè)與細(xì)胞周期蛋白e1相互作用的lncRNA。此外，研究者從MCF7-pa和MCF7-palR細(xì)胞中提取RNA進(jìn)行l(wèi)ncRNA測(cè)序。共鑒定出829個(gè)在MCF7-palR細(xì)胞中上調(diào)的lncRNA，這些lncRNA可能在促進(jìn)CDK4/6i耐藥中發(fā)揮作用。在這些lncRNA中，5個(gè)lncRNA（AC093297、LINC00664、PVT1、NRSN2-AS1和SNHG17）在兩種測(cè)序中均被富集，使其成為進(jìn)一步研究的候選lncRNA（圖1D）。為了驗(yàn)證序列數(shù)據(jù)，研究者進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MCF7-palR細(xì)胞中AC093297、LINC00664和SNHG17的表達(dá)水平顯著高于其親本細(xì)胞（圖1E）。
為了進(jìn)一步研究EILA的生物學(xué)特性，研究者首先測(cè)定了其在耐藥細(xì)胞及其親本細(xì)胞中的RNA水平。然后研究者通過qRT-PCR分析細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核部分來探索EILA的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)它大部分位于細(xì)胞核（超過70%），少數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)（約20%）（圖1F）。與這些結(jié)果一致，RNAscope原位雜交(ISH)也證實(shí)了EILA主要定位于細(xì)胞核，并且在耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)（圖1G）。RIP、qRT-PCR和RNA pull-down實(shí)驗(yàn)以及蛋白質(zhì)印跡表明，EILA可以直接與細(xì)胞周期蛋白E1相互作用（圖1H，I）。這一發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記的重組細(xì)胞周期蛋白E1進(jìn)一步驗(yàn)證（圖1J）。此外，研究者對(duì)EILA進(jìn)行了RNA熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)，隨后對(duì)cyclin E1進(jìn)行了免疫熒光檢測(cè)，證實(shí)了它們?cè)贛CF7-palR和T47d-palR細(xì)胞核中的共定位（圖1K）?？傊?，這些結(jié)果表明，EILA與cyclin E1在細(xì)胞核內(nèi)直接相互作用，這可能在CDK4/6抑制劑耐藥中起重要作用。
3. EILA參與細(xì)胞周期調(diào)控并與乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)
為了評(píng)估EILA在乳腺癌中的臨床意義，研究者分析了癌癥基因組圖譜乳腺浸潤性癌數(shù)據(jù)庫中109對(duì)配對(duì)的正常和腫瘤組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)（圖2A）。結(jié)果表明，EILA在腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常組織。此外，qRT-PCR分析了47對(duì)來自中山大學(xué)孫逸夫紀(jì)念醫(yī)院的正常和腫瘤組織（SYSMH隊(duì)列1，n=47），結(jié)果也顯示EILA在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)（圖2B）。這些發(fā)現(xiàn)被RNA ISH進(jìn)一步證實(shí)，表明EILA在乳腺癌中異常表達(dá)（圖2C）。為了評(píng)估EILA的預(yù)后價(jià)值，研究者分析了bc-GenExMiner v4.7數(shù)據(jù)庫中的乳腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。EILA高表達(dá)與較短的無病生存期（DFS）相關(guān)（圖2D）。在亞組分析中，EILA高表達(dá)預(yù)示雌激素受體陽性（ER）乳腺癌患者預(yù)后較差，但在雌激素受體陰性（ER+?）乳腺癌患者中無上述情況，提示其可能作為ER乳腺癌的生物標(biāo)志物（圖2D）。與在線數(shù)據(jù)庫的結(jié)果一致，研究者在一個(gè)獨(dú)立隊(duì)列（SYSMH隊(duì)列2，n=215）中證實(shí)，在ER/HER2+ -乳腺癌患者中，EILA高表達(dá)與較差的臨床結(jié)局相關(guān)（圖2E）。單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示，只有EILA和細(xì)胞周期蛋白E1的表達(dá)是ER/HER2+ -乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素?？傊@些結(jié)果表明EILA和cyclin E1蛋白都是預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。
Rb是一個(gè)腫瘤抑制因子，在細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)變過程中被磷酸化，而Ki67是癌細(xì)胞的增殖標(biāo)記物。通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)磷酸化Rb（pRb）和Ki67的表達(dá)，以確定EILA是否與細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖相關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)，與EILA低表達(dá)組相比，EILA高表達(dá)組腫瘤中pRb和Ki67的表達(dá)水平更高，這表明EILA過表達(dá)與細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖呈正相關(guān)（圖2、H和I）。在單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中，較高的EILA表達(dá)與Ki67表達(dá)顯著相關(guān)，但與年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或臨床分期無顯著相關(guān)。然而，未發(fā)現(xiàn)所分析的因素與細(xì)胞周期蛋白E1表達(dá)有顯著相關(guān)性。為了進(jìn)一步探索EILA在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用，研究者分析了TCGA-BRCA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。根據(jù)EILA表達(dá)水平將患者分為高表達(dá)組（n=554）和低表達(dá)組（n=537）。基因集富集分析結(jié)果顯示，HALLMARK_E2F_TARGETS基因集和GOBP_MEIOTIC_CELL_CYCLE_PROCESS基因集在高EILA組中比在低EILA組中顯著富集（圖2J）。此外，對(duì)與EILA表達(dá)最正相關(guān)的500個(gè)基因進(jìn)行GO分析顯示，細(xì)胞周期通路正調(diào)控高度富集（圖2K）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明EILA是一種預(yù)后生物標(biāo)志物，并與乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)展的正向調(diào)節(jié)相關(guān)。
圖2 EILA提示乳腺癌患者預(yù)后不良
4. EILA在體外促進(jìn)細(xì)胞增殖和CDK4/6抑制劑耐藥
EILA是一種與細(xì)胞周期蛋白e1相互作用的lncRNA，在CDK4/6i耐藥中發(fā)揮重要作用，與細(xì)胞周期進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。在MCF7-palR和T47D-palR細(xì)胞中，EILA敲低降低了細(xì)胞增殖并恢復(fù)了對(duì)哌柏西利的敏感性（圖3A，B）。此外，EdU摻入實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞周期分析表明，EILA敲低降低了DNA合成并導(dǎo)致G1-S期阻滯，并且在哌柏西利處理后，這種減少程度更大（圖3C，D），衰老相關(guān)的β半乳糖苷活性測(cè)定表明，EILA敲低誘導(dǎo)了耐藥細(xì)胞的衰老，這一過程被哌柏西利進(jìn)一步增強(qiáng)（圖3E）?？傊@些結(jié)果表明EILA對(duì)CDK4/6i耐藥細(xì)胞的耐藥性是必需的。
此外，研究者通過在MCF-7和T47D親本（MCF7-pa和T47D-pa）細(xì)胞中過表達(dá)EILA進(jìn)行了功能獲得分析。結(jié)果表明，EILA過表達(dá)使其對(duì)哌柏西利產(chǎn)生耐藥性（圖3F，G）。此外，在哌柏西利處理存在的情況下，MCF7-pa和T47D-pa細(xì)胞中EILA的強(qiáng)表達(dá)增加了DNA合成，并促進(jìn)了G1-S過渡（圖3H，I）。異位表達(dá)的EILA還減少了哌柏西利誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老（圖3J）。綜上所述，這些結(jié)果表明EILA能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)CDK4/6i的耐藥性。
圖3 EILA是CDK4/6抑制劑耐藥所必需的
5. EILA的發(fā)夾A通過與其c末端結(jié)構(gòu)域相互作用來穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白E1蛋白
為了探究EILA與細(xì)胞周期蛋白E1的相互作用和調(diào)控機(jī)制，研究者在MCF7-palR和T47D-palR細(xì)胞中沉默EILA，并分別用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白E1的表達(dá)。研究者發(fā)現(xiàn)，敲低EILA降低了細(xì)胞周期蛋白E1的蛋白水平，但對(duì)其mRNA水平影響不大（圖4A，B）。此外，沉默EILA顯著縮短了細(xì)胞周期蛋白E1的半衰期（圖4C），表明敲低EILA有助于細(xì)胞周期蛋白E1的降解。另一方面，EILA的強(qiáng)表達(dá)上調(diào)了細(xì)胞周期蛋白E1的蛋白水平，延長了其半衰期，但不影響其mRNA水平（圖4D-F）。這些結(jié)果表明，EILA通過保護(hù)細(xì)胞周期蛋白E1免受降解而上調(diào)其表達(dá)。
最近的研究表明，特定的lncRNA可能具有明確的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)可能在它們與蛋白質(zhì)的相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了確定與細(xì)胞周期蛋白E1相互作用的EILA的核苷酸序列，研究者使用一系列EILA缺失突變進(jìn)行RNA pull down，然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果顯示，包含核苷酸1~180的EILA突變體與細(xì)胞周期蛋白E1蛋白的結(jié)合效率與全長EILA相同，而核苷酸1~180缺失的EILA突變體失去了與細(xì)胞周期蛋白E1蛋白的結(jié)合能力（圖4G，H）。研究者發(fā)現(xiàn)，發(fā)夾A的強(qiáng)表達(dá)增加了細(xì)胞周期蛋白E1蛋白表達(dá)，延長了其半衰期，而不影響其mRNA水平（圖4I）。這些結(jié)果表明，EILA的發(fā)夾A是必需的，并負(fù)責(zé)與細(xì)胞周期蛋白E1的相互作用來調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性。
為了確定cyclin E1與EILA的精確相互作用域，研究者構(gòu)建了ha標(biāo)記的全長和截短的cyclin E1過表達(dá)載體。正如RNA pull down的結(jié)果所示，只有F2截短突變體可以被生物素標(biāo)記的EILA下拉，這表明C端是細(xì)胞周期蛋白E1與EILA的相互作用區(qū)域（圖4J，K）。正如預(yù)期的那樣，RIP-qPCR試驗(yàn)也顯示EILA被F2截短突變體富集（圖4L）。這些結(jié)果表明，EILA與細(xì)胞周期蛋白E1蛋白在其C末端相互作用。
圖4 EILA的發(fā)夾A通過與其c末端結(jié)構(gòu)域相互作用來穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白E1蛋白
6. EILA抑制細(xì)胞周期蛋白E1與FBXW7的結(jié)合
眾所周知，cyclin E1的蛋白穩(wěn)定性受到泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解的精確控制，cyclin E1的磷酸化位點(diǎn)調(diào)節(jié)其泛素化。由于EILA與細(xì)胞周期蛋白E1的C端相互作用并使其穩(wěn)定，因此研究者假設(shè)EILA可能影響其C端磷酸化位點(diǎn)和泛素化介導(dǎo)的降解。因此，研究者檢測(cè)了耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞中cyclin E1的c末端磷酸化位點(diǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)，與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞表達(dá)的s384磷酸化的細(xì)胞周期蛋白E1水平較低（圖5A）。為了排除CDK2和GSK3β對(duì)細(xì)胞周期蛋白E1磷酸化的影響，研究者在耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞中檢測(cè)了它們的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞表達(dá)相似的CDK2和GSK3β水平（圖5A）。采用免疫共沉淀和細(xì)胞周期蛋白E1特異性抗體泛素化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF7-pa和MCF7-palR細(xì)胞中泛素化細(xì)胞周期蛋白E1的水平。與研究者的假設(shè)一致，泛素化介導(dǎo)的cyclin E1降解水平在耐藥細(xì)胞中降低，而不是在親本細(xì)胞中（圖5B）。這些結(jié)果表明，耐藥細(xì)胞中s384磷酸化cyclin E1的減少可能抑制其泛素化介導(dǎo)的降解。為了確定EILA在調(diào)節(jié)s384磷酸化的細(xì)胞周期蛋白E1和泛素化介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白E1降解中的作用，研究者使用特定的ASO沉默EILA，發(fā)現(xiàn)EILA敲低顯著增加了s384磷酸化的細(xì)胞周期蛋白E1和泛素化的細(xì)胞周期蛋白E1的水平（圖5C，D）。另一方面，EILA過表達(dá)降低了磷酸化的細(xì)胞周期蛋白E1和泛素化介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白E1降解（圖5E，F(xiàn)）。這些結(jié)果表明，EILA調(diào)節(jié)cyclin E1對(duì)S384的磷酸化及其泛素化，從而增加其穩(wěn)定性。
為了檢測(cè)FBXW7是否在CDK4/6i耐藥細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白E1的穩(wěn)定性，研究者檢測(cè)了細(xì)胞周期蛋白E1和FBXW7之間的結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)MCF7-palR細(xì)胞中與FBXW7結(jié)合的細(xì)胞周期蛋白E1少于MCF7-pa細(xì)胞（圖5G）。為了確定FBXW7是否在EILA介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白E1穩(wěn)定性調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，研究者在MCF7-palR細(xì)胞中沉默EILA，并通過免疫共沉淀檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白E1與FBXW7的結(jié)合。研究者發(fā)現(xiàn)，敲低EILA使更多的細(xì)胞周期蛋白E1與FBXW7結(jié)合（圖5H），這表明EILA阻礙了細(xì)胞周期蛋白E1與FBXW7之間的結(jié)合。此外，在FBXW7敲低的MCF7-palR細(xì)胞中，沉默EILA的表達(dá)并不能降低細(xì)胞周期蛋白E1的表達(dá)，這表明FBXW7參與了EILA介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白E1穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)（圖5I）。研究者進(jìn)一步探索了泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解在EILA介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白E1穩(wěn)定性調(diào)節(jié)中的作用，發(fā)現(xiàn)在蛋白酶體抑制劑MG-132處理的MCF7-palR細(xì)胞中，EILA敲低不能降低細(xì)胞周期蛋白E1（圖5J）?？傊@些結(jié)果表明，EILA通過破壞細(xì)胞周期蛋白E1與FBXW7的結(jié)合并抑制其泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解來穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白E1。
圖5 EILA可阻礙細(xì)胞周期蛋白E1的泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解
7. CTCF/CDK8/TFII-I復(fù)合物調(diào)節(jié)EILA的表達(dá)
為了確定調(diào)控EILA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，研究者對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)的不同截短突變體進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告分析。研究者發(fā)現(xiàn)-500~0bp（堿基對(duì)）區(qū)域?qū)晒馑孛富钚灾陵P(guān)重要，這表明EILA的轉(zhuǎn)錄因子可能與該區(qū)域結(jié)合（圖6A）。接下來，研究者使用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)之前未知的EILA轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)CTCF在結(jié)合評(píng)分中排名前列（圖6B）。此外，CTCF敲低顯著降低了EILA的表達(dá)及其熒光素酶啟動(dòng)子活性（圖6C，D）。在CTCF轉(zhuǎn)錄因子的?500到0bp區(qū)域有兩個(gè)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)，分別命名為P1和P2位點(diǎn)。P1位點(diǎn)的突變，而不是P2位點(diǎn)的突變，顯著降低了EILA的熒光素酶啟動(dòng)子活性，表明P1位點(diǎn)是CTCF的主要結(jié)合位點(diǎn)（圖6E，F(xiàn)）。此外，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）-PCR實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了EILA啟動(dòng)子區(qū)域含有CTCF結(jié)合位點(diǎn)（圖6G）。這些發(fā)現(xiàn)得到了cisstrome數(shù)據(jù)瀏覽器上的ChIP測(cè)序數(shù)據(jù)的進(jìn)一步證實(shí)，EILA啟動(dòng)子包含CTCF結(jié)合位點(diǎn)（圖6H）。
CTCF是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的多功能調(diào)節(jié)因子，包括轉(zhuǎn)錄激活和抑制。它招募并結(jié)合蛋白伴侶來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，如TFII-I和CDK8。此外，ChIP-PCR檢測(cè)也顯示EILA啟動(dòng)子區(qū)域含有CDK8結(jié)合位點(diǎn)（圖6I）。研究者還觀察到，與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞中TFII-I、CDK8和CTCF的相互作用更強(qiáng)（圖6J），這表明CTCF可能與TFII-I和CDK8協(xié)同促進(jìn)EILA表達(dá)。為了探索CDK8和TFII-I在調(diào)節(jié)EILA表達(dá)中的作用，研究者在耐藥細(xì)胞中沉默了CDK8和TFII-I，并發(fā)現(xiàn)CDK8和TFII-I的敲低顯著降低了EILA的表達(dá)（圖6K）。為了確定CDK8和TFII-1是否在CDK4/6i耐藥中發(fā)揮作用，研究者評(píng)估了CDK8和TFII-1敲低后的哌柏西利敏感性，發(fā)現(xiàn)CDK8和TFII-I敲低均恢復(fù)了耐藥細(xì)胞對(duì)CDK4/6i的敏感性（圖6L，M）。這些結(jié)果表明，CTCF/CDK8/TFII-I復(fù)合物通過與EILA啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合來調(diào)節(jié)其表達(dá)，并維持對(duì)CDK4/6抑制劑的耐藥性。在CDK4/6抑制劑治療后，通過CDK8抑制劑靶向EILA表達(dá)可能是一種有前景的策略。
圖6 EILA的表達(dá)受CTCF/CDK8/TFII-I復(fù)合物的調(diào)節(jié)
8. EILA促進(jìn)體內(nèi)CDK4/6抑制劑耐藥
為了進(jìn)一步確定EILA是否在體內(nèi)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)CDK4/6i的耐藥性，研究者將MCF7-palR細(xì)胞接種到非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪墊中。在腫瘤可觸及后，將其隨機(jī)分為6組，分別給予對(duì)照溶液、哌柏西利、HLA特異性ASO、對(duì)照ASO及其聯(lián)合治療。與之前的體外研究結(jié)果一致，EILA特異性ASO顯著抑制了腫瘤生長，而哌柏西利和EILA特異性ASO的組合進(jìn)一步縮小了腫瘤（圖7A，B），表明EILA特異性ASO使耐藥腫瘤對(duì)CDK4/6抑制劑重新敏感。此外，哌柏西利和EILA特異性ASO的組合對(duì)小鼠體重的影響很?。▓D7C），這表明這些組合是可耐受的。
EILA特異性ASO顯著降低了EILA的表達(dá)和細(xì)胞周期蛋白E1的蛋白水平（圖7D，E）。此外，EILA敲低也顯著降低了Ki67和pRb的表達(dá)，palbociclib和EILA特異性ASO的組合更大程度地降低了它們的表達(dá)（圖7D，E）。總之，這些結(jié)果表明，用特異性ASO靶向EILA的表達(dá)在體內(nèi)克服了CDK4/6i的耐藥性。
圖7 EILA促進(jìn)體內(nèi)CDK4/6抑制劑耐藥
9. EILA可預(yù)測(cè)對(duì)CDK4/6抑制劑的應(yīng)答，并且在CDK4/6抑制劑進(jìn)展后上調(diào)
為了進(jìn)一步證明EILA在CDK4/6i耐藥中的臨床意義，研究者檢測(cè)了37例接受CDK4/6抑制劑治療的ER晚期乳腺癌患者中EILA的表達(dá)。根據(jù)EILA的ISH評(píng)分將患者分為高EILA組和低EILA組。Kaplan-Meier曲線分析顯示，EILA高表達(dá)預(yù)測(cè)這些患者的PFS縮短（圖8A）。同樣，cyclin E1蛋白高表達(dá)也與這些患者的不良臨床結(jié)局相關(guān)（圖8B）。此外，在治療前和CDK4/6抑制劑治療進(jìn)展后，對(duì)這些患者進(jìn)行了7對(duì)活檢。對(duì)這些配對(duì)活檢進(jìn)行的分析表明，耐藥腫瘤的EILA表達(dá)水平高于na?ve腫瘤，細(xì)胞周期蛋白E1蛋白上調(diào)（圖8C，D）。這些結(jié)果表明，EILA表達(dá)與CDK4/6抑制劑應(yīng)答相關(guān)，并且在進(jìn)展后上調(diào)，這可能是CDK4/6i耐藥的生物標(biāo)志物，并可作為克服耐藥的治療靶點(diǎn)。
圖8 EILA預(yù)測(cè)對(duì)CDK4/6i治療反應(yīng)差，并且在CDK4/6i耐藥的乳腺癌中上調(diào)
結(jié)論
綜上所述，該研究表明在E1相互作用的lncRNA EILA中，cyclin-交互lncRNA EILA在調(diào)節(jié)環(huán)蛋白E1穩(wěn)定性和保持對(duì)CDK4/6抑制劑的抗性方面起著重要的作用。EILA是CDK4/6i治療的一個(gè)預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，也是CDK4/6i進(jìn)展后的潛在治療目標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)方法
RNA免疫沉淀，RIP測(cè)序，lncRNA測(cè)序，RNA ISH，IHC，RNA FISH，免疫熒光，RNA scope，蛋白質(zhì)印跡，免疫共沉淀，泛素化測(cè)定，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，染色質(zhì)免疫沉淀，RNA pull-down，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，小鼠腫瘤異種移植物形成，EILA，菌落形成測(cè)定，EdU摻入實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期流式細(xì)胞術(shù)
參考文獻(xiàn)
Cai Z, Shi Q, Li Y, Jin L, Li S, Wong LL, Wang J, Jiang X, Zhu M, Lin J, Wang Q, Yang W, Liu Y, Zhang J, Gong C, Yao H, Yao Y, Liu Q. LncRNA EILA promotes CDK4/6 inhibitor resistance in breast cancer by stabilizing cyclin E1 protein. Sci Adv. 2023 Oct 6;9(40):eadi3821. doi: 10.1126/sciadv.adi3821.