胃癌源性LBP通過促進肝內(nèi)纖維化微環(huán)境形成促進肝轉(zhuǎn)移

       胃癌（GC）是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第6位的惡性腫瘤，死亡率很高。肝轉(zhuǎn)移（LM）是胃癌主要的血液學轉(zhuǎn)移，約4-14%的胃癌患者在初診期被檢測到。此外，它占接受根治性胃切除術(shù)的胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率的37%。不幸的是，由于檢測的延遲和目前治療的有限療效，GC-LM患者的預(yù)后仍然非常差，5年以上的生存率低于10%。因此，有必要進一步研究GC-LM的機制以確定潛在的診斷標志物和有效的治療靶點，以便早期發(fā)現(xiàn)和改進干預(yù)。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，腫瘤細胞從原發(fā)部位擴散到外來器官，最終建立繼發(fā)性腫瘤。根據(jù)“種子和土壤”假說，腫瘤細胞和靶器官微環(huán)境之間的溝通在很大程度上決定了轉(zhuǎn)移的療效。新證據(jù)提示，原發(fā)腫瘤可通過分泌可溶性因子重塑外來器官的微環(huán)境，從而啟動轉(zhuǎn)移。這一過程創(chuàng)造了允許和支持的微環(huán)境，促進癌細胞在遠處器官的定植和生長。這些有利于轉(zhuǎn)移的微環(huán)境被稱為轉(zhuǎn)移前微環(huán)境（PMNs）。PMNs具有多種特征，包括細胞外基質(zhì)（ECM）重編程、免疫抑制、炎癥、血管生成/血管通透性、淋巴管生成、器官趨向性。越來越多證據(jù)表明，分泌蛋白作為腫瘤細胞與外界微環(huán)境之間的主要介質(zhì)，可通過誘導PMNs促進腫瘤轉(zhuǎn)移。然而，GC分泌蛋白在GC-LM中的作用尚不清楚。鑒定肝內(nèi)PMNs的關(guān)鍵分泌蛋白可能是早期檢測GC-LM的新策略，研究其潛在機制可能為開發(fā)有效預(yù)防和控制GC-LM提供新的治療靶點。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.16。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. LBP分泌與胃癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與胃癌患者較差的預(yù)后相關(guān)

       采用DIA-MS對5例GC-LM患者和5例GC-NLM患者的血清樣本進行檢測，篩選可能與GC-LM相關(guān)的腫瘤分泌蛋白。兩組中檢測到49種失調(diào)的分泌蛋白，如圖1A所示。此外，研究者在之前的研究中對24對胃癌和匹配的正常胃黏膜進行了mRNA表達微陣列分析，以確定胃癌中最失調(diào)的基因（圖1B）。隨后，通過ELISA（圖1C）和qRT-PCR，LBP被驗證為與GC-LM相關(guān)的最顯著的分泌蛋白。對一個胃癌患者隊列進行WB和IHC，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中LBP的表達高于癌旁正常組織（圖1D，E）；此外，研究者觀察到，與GC-NLM組織相比，LM組織的LBP表達高于原發(fā)腫瘤（圖1E，F(xiàn)）。對30例GC-LM患者和30例GC-NLM患者既往血清學LBP水平的ROC曲線分析表明，血清學LBP水平有可能作為GC-LM的診斷生物標志物（圖1G）。在另一個胃癌患者隊列中進一步進行了無LM生存分析，發(fā)現(xiàn)血清LBP水平較高的患者在根治性胃切除術(shù)后更容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移（圖1H）。綜上所述，這些結(jié)果表明，GC來源的LBP與GC-LM相關(guān)，并與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。

圖1 LBP分泌與胃癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與不良預(yù)后相關(guān)

2. LBP促進GC-LM

       通過WB和qRT-PCR檢測7種胃癌細胞株和正常胃黏膜上皮細胞株（GES-1）中LBP的表達水平。結(jié)果表明，與GES-1細胞相比，大多數(shù)胃細胞系具有更高的LBP表達水平（圖2A）。此外，MKN45細胞的條件培養(yǎng)基（CM）含有最高水平的LBP（圖2A）。這些結(jié)果得到了IF染色的證實（圖2B）。接下來，利用短發(fā)夾RNA構(gòu)建LBP穩(wěn)定過表達的胃癌細胞株AGS和LBP高水平內(nèi)源性LBP穩(wěn)定敲低的胃癌細胞株MKN45，通過qRT-PCR和WB進行驗證。研究者開發(fā)了LM的新型改良脾內(nèi)注射小鼠模型，以在BABL/c裸鼠體內(nèi)驗證LBP在LM中的功能作用（圖2C）。值得注意的是，每周進行一次的活體生物發(fā)光成像（BLI）顯示，在AGS細胞中LBP的過表達顯著加劇了脾內(nèi)注射后LM的進展（圖2D）。脾內(nèi)注射后第5周處死小鼠，收集肝臟和脾臟，分別進行光子通量定量分析、稱重、HE染色和肝表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)計數(shù)。與此一致，AGS細胞中LBP過表達顯著增強了肝轉(zhuǎn)移負荷（圖2E，F(xiàn)）；相反，在MKN45細胞中，通過短發(fā)夾RNA敲低LBP顯著抑制LM的進展（圖2G）和減少肝轉(zhuǎn)移負荷（圖2H-K）。這些結(jié)果證明了LBP在GC-LM中的促轉(zhuǎn)移作用。

圖2 LBP在體內(nèi)對GC-LM有促進作用

3. LBP通過誘導肝內(nèi)纖維化PMN促進胃癌細胞在早期肝臟定植和生長

       為了研究LBP促進GC-LM的機制，研究者首先研究了LBP對腫瘤細胞內(nèi)在惡性程度的影響。EdU實驗和克隆形成實驗檢測LBP過表達和敲低后對MKN45和HGC-27細胞增殖的影響。這些結(jié)果表明，LBP對GC細胞的增殖沒有顯著影響（圖3A）。同樣，通過MKN45和HGC-27細胞的流式細胞術(shù)分析，LBP對胃癌細胞的凋亡沒有顯著影響（圖3B）。同樣，皮下接種異種移植瘤進一步證實LBP在體內(nèi)對皮下腫瘤的生長沒有顯著影響（圖3C，D），Ki-67的IHC染色顯示LBP對皮下腫瘤的增殖沒有顯著影響（圖3E）。此外，傷口愈合、Transwell實驗、IF和WB表明LBP對胃癌細胞的侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有輕微影響（圖3F-G）。因此，研究者提出LBP通過微環(huán)境依賴的方式促進GC-LM。

圖3 內(nèi)源性LBP對胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲遷移和間質(zhì)轉(zhuǎn)化無明顯影響

       為了證實這一假設(shè)，研究者利用重組蛋白進行了預(yù)建模，建立了小鼠模型，以證明外源性LBP對LM和肝內(nèi)微環(huán)境的影響（圖4A）。小鼠尾靜脈注射重組LBP（reLBP）或IgG，隔日1次，連續(xù)2周后，脾內(nèi)注射熒光素酶標記的GC細胞。如圖4B所示，外源性LBP顯著加劇了脾內(nèi)注射AGS細胞后LM的進展，最終導致肝轉(zhuǎn)移負荷顯著增加。值得注意的是，BLI分析顯示，使用外源性LBP預(yù)建模顯著增加了癌細胞在肝臟中的定植，即使在脾內(nèi)注射后的第一周（圖4B）。此外，在脾內(nèi)注射HGC-27細胞后的第一周內(nèi)，每天對生物發(fā)光信號的分析一致表明，LBP在早期階段增加了GC細胞在肝臟中的定植和生長（圖4C）。脾內(nèi)注射后第7天處死小鼠。代表性照片和HE染色顯示，reLBP預(yù)建模后，肝臟中GC細胞接種和生長增加（圖4D）。肝臟IF染色和流式細胞術(shù)分析進一步證實了這一結(jié)果（圖4E-F）。此外，肝臟切片的Ki-67 IHC染色提示，reLBP預(yù)建模誘導了肝臟中處于種子期的GC細胞增殖（圖4G）。因此，結(jié)果表明，外源性LBP在早期誘導PMN促進胃癌細胞在肝臟的種植和生長。

圖4 LBP通過誘導肝內(nèi)纖維化PMN形成促進GC細胞在預(yù)造模小鼠模型早期肝臟定植和生長

       正如之前的報道，髓系細胞聚集和ECM沉積被確定為PMN的關(guān)鍵特征。因此，通過尾靜脈注射PBS、IgG和reLBP，隔日1次，連續(xù)2周，觀察小鼠肝內(nèi)基質(zhì)浸潤髓樣細胞和ECM的變化。正如預(yù)期的那樣，通過IF和IHC染色，研究者發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，reLBP預(yù)建模小鼠的肝臟出現(xiàn)了hsc（α-平滑肌肌動蛋白，α-SMA）的激活增加，同時I型膠原(COL1)和纖維連接蛋白(FN)的沉積顯著增加（圖4H）。雖然觀察到reLBP處理的小鼠肝臟中浸潤的髓系細胞比對照小鼠多，但差異不顯著（圖4H）。研究者的數(shù)據(jù)表明，髓系細胞對ECM在肝臟的沉積并不是必需的，這與之前的研究結(jié)果一致。綜上所述，研究者的結(jié)果表明，LBP通過誘導肝內(nèi)纖維化PMN形成來促進胃癌細胞在早期肝臟中的種植和生長。

4. 肝內(nèi)巨噬細胞介導LBP誘導的PMN形成

       為了闡明LBP誘導PMN形成的機制，研究者首先通過尾靜脈將GFP標記的reLBP（GFP-LBP）注射到小鼠體內(nèi)，以研究LBP的器官趨向性。與預(yù)期一致的是，熒光強度分析分析顯示，與其他器官相比，肝臟中GFP-LBP的積累顯著增加（圖5A）。此外，通過IF染色鑒定肝臟中的主要細胞類型，以確定LBP的“受體”細胞。有趣的是，研究者發(fā)現(xiàn)LBP主要與F4/80 Kupffer細胞（kc）共定位（圖5B），但與HSC（結(jié)蛋白陽性細胞）不共定位。此外，從未處理的小鼠分離的原代混合肝細胞在體外與GFP-LBP蛋白孵育，結(jié)果表明GFP-LBP主要被巨噬細胞（F4/80細胞）“攝取”（圖5C）。隨后，研究者在體外用reLBP處理的THP-1細胞的CM處理LX-2（人HSC系）細胞。IF染色顯示，與對照培養(yǎng)基相比，reLBP處理的THP-1的CM顯著增加了LX-2細胞中α-SMA、COL1和FN的表達（圖5D）。WB進一步證實了這些結(jié)果（圖5E）。此外，在預(yù)建模小鼠模型中，通過腹腔注射CEL去除肝臟中的F4/80細胞，以確定肝內(nèi)ECM重塑。正如預(yù)期的那樣，肝內(nèi)巨噬細胞清除后，reLBP未能誘導HSC活化以及COL1和FN在肝臟中的沉積（圖5F）。綜上所述，這些結(jié)果表明肝內(nèi)巨噬細胞介導了LBP誘導的PMN。

圖5 GC來源的LBP主要聚集在肝臟，并與肝內(nèi)巨噬細胞共定位

5. LBP通過激活肝內(nèi)巨噬細胞TLR4/NF-κB通路，促進TGF-β1分泌，TGF-β1激活HSC，引導肝內(nèi)纖維化PMN的形成

       為了進一步研究肝內(nèi)巨噬細胞在LBP誘導的PMN形成中的作用，研究者進行了免疫沉淀分析，然后在PMA-THP-1細胞中進行了SDS-PAGE和質(zhì)譜分析（圖6A）。通過對質(zhì)譜結(jié)果和STRING數(shù)據(jù)庫的預(yù)測進行重疊分析，研究者確定TLR4是與LBP相互作用的有前景的受體蛋白（圖6B）。Co-IP實驗表明，在PMA-THP-1細胞中同時過表達LBP和TLR4后，LBP和TLR4之間存在相互作用（圖6C）。

圖6 LBP通過激活肝內(nèi)巨噬細胞TLR4/NF-κB通路，促進TGF-β1分泌，TGF-β1激活hsc，引導肝內(nèi)纖維化PMN的形成

       為了確定LBP在巨噬細胞中的功能靶點，通過mRNA測序比較IgG和reLBP處理的PMA-THP-1細胞的基因表達譜。KEGG通路分析顯示，NF-κB信號通路是reLBP影響最多的通路之一。此外，研究者觀察到TGF-β1是上調(diào)最高的基因之一（圖6D）。ELISA結(jié)果進一步證實，reLBP處理的THP-1細胞上清中TGF-β1蛋白含量明顯高于對照上清（圖6E）。IF染色（圖6F）和WB顯示LBP通過激活TLR4/NF-κB通路上調(diào)PMA-THP-1細胞中TGF-β1的表達。與此同時，研究者發(fā)現(xiàn)，與體內(nèi)對照小鼠相比，reLBP預(yù)建模小鼠的肝臟在肝內(nèi)巨噬細胞（f4/80細胞）中TGF-β1的表達顯著增加（圖6G）。隨后，應(yīng)用抗TGF-β中和抗體和選擇性TGF-βⅰ型受體激酶抑制劑galunisertib在體外驗證TGF-β1是否直接調(diào)控LX-2細胞的活化。正如預(yù)期的那樣，IF染色顯示，抗TGF-β中和抗體和galunisertib減弱了來自reLBP處理的THP-1細胞的CM誘導的LX-2中α-SMA、COL1和FN的過表達（圖6I）。同樣，WB也證明了抗TGF-β1抗體和galunisertib抑制TGF-β/Smad信號通路，從而阻斷reLBP處理的THP-1細胞的CM誘導的LX-2活化（圖6J）。綜上所述，這些結(jié)果表明LBP激活肝內(nèi)巨噬細胞的TLR4/NF-κB通路，促進TGF-β1分泌，進而激活HSC，指導肝內(nèi)纖維化PMN的形成。

6. galunisertib選擇性靶向TGF-β/Smad通路可有效預(yù)防小鼠GC-LM

       鑒于TGF-β/Smad通路在枸杞多糖誘導的肝纖維化中的關(guān)鍵作用，本研究旨在探討靶向枸杞多糖或TGF-β/Smad通路能否有效防治GC-LM。體內(nèi)實驗采用抗LBP抗體和選擇性TGF-β受體I激酶小分子抑制劑galunisertib。在脾內(nèi)注射MKN45細胞的小鼠中，兩種治療均顯著抑制了LM的進展（圖7A），最終減輕了肝轉(zhuǎn)移負荷（圖7B）。免疫組織化學染色顯示肝轉(zhuǎn)移組織中TGFBR1的表達水平較高（圖7C）。此外，劃痕實驗和Transwell實驗顯示，reLBP處理的THP-1細胞的CM顯著增強MKN45細胞的遷移和侵襲能力。然而，galunisertib治療顯著減弱了這些作用（圖7D-F）。同樣，研究者發(fā)現(xiàn)，來自reLBP處理的THP-1細胞的CM通過激活TGF-β/Smad信號通路顯著增加MKN45細胞的肌動蛋白重構(gòu)，而galunisertib通過下調(diào)p-Smad3的表達顯著抑制這種肌動蛋白重構(gòu)（圖7G）。這些結(jié)果表明，GC來源的LBP誘導肝內(nèi)TGF-β1表達增加，可增強轉(zhuǎn)移性胃癌細胞的遷移和侵襲能力，進一步促進癌細胞在肝臟的定植。綜上所示，選擇性靶向TGF-β/Smad信號通路的galunisertib通過抑制纖維化中性粒細胞的形成和減少肝臟轉(zhuǎn)移性胃癌細胞的遷移和侵襲來有效預(yù)防GC-LM。

圖7 galunisertib選擇性靶向TGF-β/Smad信號通路可有效預(yù)防小鼠GC-LM

結(jié)論

       該研究揭示了GC衍生的LBP在GC-LM中的新作用。具體地，研究者確定了GC來源的LBP激活了肝內(nèi)巨噬細胞的TLR4/NF-κB通路，導致TGF-β1的分泌增加。隨后，TGF-β1進一步激活HSC，調(diào)控肝內(nèi)纖維化PMN的形成。此外，肝內(nèi)TGF-β1增強了轉(zhuǎn)移性胃癌細胞在肝內(nèi)的遷移和侵襲。重要的是，這些發(fā)現(xiàn)表明，血清LBP可以作為一種新的診斷生物標志物，用于早期檢測GC-LM。此外，galunisertib選擇性靶向TGF-β通路是一種有前景的GC-LM預(yù)防和治療策略。

機制圖

實驗方法

微陣列分析，細胞培養(yǎng)，RNA提取和定量PCR處理，質(zhì)粒和慢病毒轉(zhuǎn)染，蛋白質(zhì)印跡，流式細胞術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附法，H&E染色和免疫組織化學（IHC）染色，免疫熒光（IF）染色，mRNA測序，免疫沉淀和質(zhì)譜，EdU測定，傷口愈合試驗，小鼠實驗

參考文獻

Xie L, Qiu S, Lu C, Gu C, Wang J, Lv J, et al. Gastric cancer-derived LBP promotes liver metastasis by driving intrahepatic fibrotic pre-metastatic niche formation. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Oct 3;42(1):258. doi: 10.1186/s13046-023-02833-8.