FTO通過消除TNIP1的m6A甲基化，促進糖尿病誘導的血管內(nèi)皮與炎癥相關的功能障礙

       內(nèi)皮功能障礙是糖尿病血管并發(fā)癥的關鍵和起始因素。炎癥在表觀遺傳修飾調(diào)控的內(nèi)皮功能障礙中起重要作用。N6-甲基腺苷（m6A）是真核細胞中最普遍的表觀遺傳修飾之一。在本研究中，作者鑒定了去m6A修飾酶，質(zhì)量及肥胖相關蛋白（FTO），在糖尿病誘導的血管上皮細胞紊亂中一種極其重要的表觀轉錄組學的調(diào)控子。作者發(fā)現(xiàn)增強的FTO降低了高血糖患者m6A的整體水平。內(nèi)皮細胞（EC）中FTO敲低導致炎癥減少，遷移和管形成能力增強。與ECFTO^fl/fl糖尿病小鼠相比，EC-specific FTO-deficient（ECFTO^Δ/Δ）糖尿病小鼠展示了視網(wǎng)膜血管滲透少，非細胞性毛細血管生成減少。進一步，甲基化RNA immunoprecipitation sequencing (MeRIP-Seq) 結合RNA-seq表明Tnip1是FTO的下游靶點。雙熒光素酶實驗和RNA pull-down實驗說明FTO通過消除m6A甲基化抑制TNIP1 mRNA的表達。此外，TNIP1消耗激活NF-κB和其他炎癥因子，加強了視網(wǎng)膜血管滲透和非細胞型毛細血管形成，而通過玻璃體內(nèi)注射顯像管病毒持續(xù)表達TNIP1可減輕內(nèi)皮損傷。這些發(fā)現(xiàn)表明FTO-TNIP1-NF-κB網(wǎng)絡為治療糖尿病血管并發(fā)癥提供了潛在的靶點。本研究于2023年10月發(fā)表在《Journal of Clinical Investigation》上，IF：15.9。

技術路線

主要研究內(nèi)容

1、 在糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙中檢測到m6A降低和FTO升高

       為誘導糖尿病誘導的視網(wǎng)膜損傷疾病中m6A的作用，作者首先通過點陣圖探索了1型或2型糖尿病患者視網(wǎng)膜纖維血管膜的m6A水平。與特發(fā)性視網(wǎng)膜阡陌患者相比，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的m6A水平較低，與糖尿病類型無關（圖1A）。腹腔注射streptozotocin（STZ）構建糖尿病模型。RNA-seq檢測糖尿病視網(wǎng)膜中差異表達基因。熱圖顯示了糖尿病視網(wǎng)膜中m6A相關基因的概述。糖尿病小鼠FTO持續(xù)升高（圖1B）。qRT-PCR檢測m6A相關基因（包括FTO和ALKBH5等）的mRNA水平。結果證實，1型（圖1C）和2型（圖1D）糖尿病視網(wǎng)膜病變患者FTO明顯升高。糖尿病患者視網(wǎng)膜纖維血管膜FTO水平升高近1.8~2.3倍（1型糖尿病，圖1E；2型糖尿病，圖1F）。

       為確定FTO在糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙中的作用，作者通過玻璃體內(nèi)注射含有過表達質(zhì)粒或siRNA的腺相關病毒（AAV）載體來調(diào)節(jié)其表達。過表達FTO顯著加重糖尿病患者視網(wǎng)膜血管滲漏（圖1G），增加脫細胞毛細血管的數(shù)量（圖1H），而FTO敲低則會減輕這些微血管損傷。這些數(shù)據(jù)表明糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙的特征是m6A修飾減少，可能是通過調(diào)節(jié)FTO的增強。

圖1-糖尿病在人和小鼠中誘導m6A修飾降低和FTO表達增加

2、FTO加速糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙

       為系統(tǒng)地闡明FTO在糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙中的功能，作者制造了EC-specific FTO-deficient（ECFTO^Δ/Δ）小鼠（圖2A）。為了驗證成功敲除FTO，使用抗FTO抗體對小鼠視網(wǎng)膜血管進行免疫染色，結果證實內(nèi)皮細胞FTO蛋白完全敲除（圖2B）。此外，研究提取原代小鼠視網(wǎng)膜ECs的基因組DNA并進行PCR分析，結果證實ECFTO^Δ/Δ小鼠的FTO位點成功發(fā)生cre介導的重組（圖2C）。進一步的Western blotting驗證了FTO蛋白在ECFTO^Δ/Δ小鼠ECs中的缺失（圖2D）。此外，斑點雜交實驗顯示ECFTO^Δ/Δ小鼠中m6A水平增加（圖2E）。作者探討了FTO在糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙中的功能作用。Evans blue leakage assays顯示，內(nèi)皮缺失FTO緩解了糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管滲漏（圖2F）。與此一致，ECFTO^Δ/Δ小鼠視網(wǎng)膜中顯示較少的脫細胞毛細血管（圖2G）。

       在體外，高糖可增強HRMECs炎癥細胞因子（IL-1β、IL-18）分泌、遷移能力（圖2H）、成管能力（圖2I）、增殖和凋亡；然而，這些趨勢能夠被敲低FTO所逆轉。綜上所述，F(xiàn)TO在體內(nèi)和體外都加重了糖尿病相關的視網(wǎng)膜血管功能障礙和炎癥。

圖2-FTO引起糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙

3、MeRIP-Seq聯(lián)合RNA-Seq鑒定Tnip1是一個潛在的FTO介導的靶點

       采用甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-Seq）結合RNA Seq，進行3個獨立的生物重復預測糖尿病中m6A修飾的靶標。在MeRIP-Seq中，在典型RRACH基序中檢測到m6A峰（圖3A），并在靠近停止密碼子的3’-UTR富集（圖3B）。不同m6A位點數(shù)量的基因分布如圖4B所示。與正常的視網(wǎng)膜相比，在糖尿病條件下，313個轉錄本具有較少富集的m6A修飾，176個轉錄本具有增加的m6A峰值富集（圖3C）。基因本體（GO）分析表明，差異表達基因主要富集于幾種信號通路，包括胰島素應答、血管EC增殖正向調(diào)控、葡萄糖代謝過程等（圖3D）。

       聯(lián)合RNA-Seq和MeRIP-Seq預測了糖尿病中43個差異表達基因，其中12個是FTO的直接效應子。Tnip1，mRNA水平顯著降低和m6A峰值，被確定為糖尿病應激下m6A修飾的靶標（圖3E）。與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病樣本在TNIP1 mRNA的3’-UTR中顯示出更少的reads（圖3F）和m6A峰（圖3G）。因此，作者推測FTO可能通過RNA去甲基化Tnip1導致糖尿病視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙。

圖3- MeRIP-Seq聯(lián)合RNA-Seq鑒定Tnip1是一個潛在的FTO介導的靶點

4、TNIP1減輕糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙

       為證實測序結果，作者證明在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者（圖4A）、糖尿病小鼠視網(wǎng)膜（圖4B）和高糖治療的HRMECs的視網(wǎng)膜纖維血管膜中，TNIP1蛋白水平降低，并伴有FTO上調(diào)（圖4C）。RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)糖尿病患者視網(wǎng)膜纖維血管膜（圖4D）、小鼠視網(wǎng)膜（圖4E）和HRMECs（圖4F）中TNIP1 mRNA的m6A修飾減少。作者進一步確定了TNIP1在糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管功能障礙中的作用。在視網(wǎng)膜中持續(xù)表達Tnip1可顯著減少視網(wǎng)膜血管滲漏（圖5A）和脫細胞毛細血管的數(shù)量（圖5B）。

       體外實驗表明TNIP1在高糖培養(yǎng)的HRMECs中顯著抑制遷移（圖5C）和管形成（圖5D）。TNIP1增強顯著改善了高糖誘導的IL-1β和IL-18的富集、增殖和凋亡?？傊?，這些結果表明，TNIP1在體內(nèi)外均可減輕糖尿病相關的視網(wǎng)膜血管功能障礙和炎癥。

圖4-糖尿病患者TNIP1及其m6A修飾水平降低

圖5-Tnip1減輕糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙

5、FTO-TNIP1-NF-κB網(wǎng)絡調(diào)控糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙

       TNIP1是NF-κB通路的抑制因子，參與抗炎反應和自身免疫。作者假設FTO調(diào)節(jié)TNIP1-NF-κB通路，激活炎癥細胞因子，最終導致內(nèi)皮損傷。為驗證此機制，作者首先驗證了ECFTO^fl/fl和ECFTO^Δ/Δ小鼠中FTO、TNIP1和NF-κB水平。在糖尿病ECFTOfl/fl小鼠中，F(xiàn)TO上調(diào)，TNIP1降低，NF-κB（p105/p50）水平升高，而在ECFTO^Δ/Δ小鼠中，TNIP1上調(diào)，NF-κB抑制（圖6A）。通過轉染siRNA或過表達質(zhì)粒在HRMES中調(diào)節(jié)FTO表達，TNIP1蛋白（圖6B）和mRNA水平與FTO表達呈負相關，而NF-κB則與FTO呈正相關。在ECFTO^Δ/Δ小鼠中，通過玻璃體內(nèi)注射AAV載體沉默Tnip1會加劇視網(wǎng)膜血管滲漏（圖6C）和脫細胞毛細血管形成（圖6D）。同樣，敲低TNIP1在抑制HRMES中FTO后，會增加IL-1β和IL-18的炎癥水平、管形成和凋亡率。此外，免疫熒光分析顯示，受抑制的FTO可下調(diào)高糖組織中NF-κB的表達，而這種效應在敲低TNIP1后變得不顯著（圖6E）。

圖6-FTO-TNIP1-NF-κB網(wǎng)絡調(diào)控糖尿病誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮功能障礙

6、FTO通過m6A甲基化調(diào)控TNIP1 RNA表達

       為了研究FTO介導的m6A修飾TNIP1的機制，作者進行了RIP實驗，結果顯示，與ECFTO^fl/fl小鼠相比，ECFTO^Δ/Δ小鼠豐富了TNIP1 mRNA的m6A修飾（圖7A）。沉默F(xiàn)TO后，HRMES中TNIP1 mRNA的m6A水平顯著升高（圖7B）。此外，在給藥Dactinomycin后，研究了TNIP1 mRNA的穩(wěn)定性。qRT-PCR結果顯示，TNIP1的半衰期約為10小時，沉默F(xiàn)TO可延長半衰期，增強FTO可縮短半衰期（圖7C）。利用TNIP1 3’-UTR或m6A位點的8個突變（MT）序列構建了Reporters，MT3-MT8位于人類、小鼠和大鼠基因組中的高度保守區(qū)域（圖7D）。在所研究的8個TNIP1錯義突變中，MT4（403A>403T）失去了抑制TNIP1轉錄的能力，另外7個突變與野生型保持不變（圖7E）。此外，RNA pull-down實驗證實，F(xiàn)TO選擇性識別動態(tài)m6A修飾，以YTHDF1為陽性參考，調(diào)節(jié)TNIP1 mRNA的壽命（圖7F）。

圖7-FTO通過m6A修飾調(diào)控Tnip1的表達

結論

       綜上所述，作者從體外、體內(nèi)和翻譯水平證明了FTO-TNIP1-NF-κB通路在調(diào)節(jié)糖尿病引起的內(nèi)皮功能障礙中的關鍵作用。FTO介導的TNIP1的RNA去甲基化激活NF-κB，從而加速糖尿病誘導的血管內(nèi)皮功能障礙。作者的數(shù)據(jù)為靶向該通路的關鍵元件來預防糖尿病的內(nèi)皮損傷提供了重要的轉化意義。然而，需要進一步的研究和臨床試驗來充分驗證其潛在的機制，F(xiàn)TO介導的糖尿病和隨后血管并發(fā)癥的的益處。

實驗方法

ECFTO^fl/fl糖尿病小鼠，ECFTO^Δ/Δ糖尿病小鼠，RNA m6A dot blot，細胞培養(yǎng)和轉染，RNA分離和qRT-PCR，Western blot，免疫共沉淀，細胞增殖、遷移和凋亡，免疫熒光，管形成實驗，RNA pull-down，熒光素酶報告基因，RIP-qPCR，RNA半衰期檢測，RNA提取、建庫 Illumina sequencing，GO分析，MeRIP-Seq

參考文獻

Zhou C, She X, Gu C, Hu Y, Ma M, Qiu Q, Sun T, Xu X, Chen H, Zheng Z. FTO fuels diabetes-induced vascular endothelial dysfunction associated with inflammation by erasing m6A methylation of TNIP1. J Clin Invest. 2023 Oct 2;133(19):e160517. doi: 10.1172/JCI160517. PMID: 37781923; PMCID: PMC10541204.