骨髓間充質干細胞新功能——其胞葬通過線粒體重塑破壞成骨細胞分化

       有效清除死亡和瀕死細胞，即胞葬，對于維持組織穩(wěn)態(tài)至關重要。在骨髓微環(huán)境（BMME）中，這一作用主要由專職骨髓巨噬細胞完成，但最近的研究表明，間充質基質細胞（MSCs）在BMME中扮演非專職吞噬細胞的角色。然而，關于胞葬對間充質干細胞及其功能的機制和影響知之甚少。本研究描述了間充質干細胞作為BMME中的非專業(yè)吞噬細胞的新功能，并證明了間充質干細胞的胞葬作用在指導線粒體重塑和間充質干細胞分化中起關鍵作用。該研究于2023年7月發(fā)表在《Cell Death & Disease》，IF：9.0。

技術路線

主要研究結果

1. 間充質基質細胞參與胞葬

       為研究胞化對間充質干細胞的影響，首先用流式細胞術分析ST2細胞（小鼠骨髓來源的間充質基質細胞系）對中性粒細胞的攝取。該檢測表明，ST2細胞對終末期小鼠中性粒細胞（PMNs）進行胞外吞噬（圖1A、B）。通過顯微鏡檢查證實ST2主動吞噬終末期PMNs，細胞質中遺留的空隙和z-堆棧成像證明了這一點（圖1C、D）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實間充質干細胞可以積極參與胞葬，但胞葬后對間充質干細胞支持正常功能的能力的影響仍有待闡明。

圖1. 間充質干細胞可進行胞葬

       為確定MSCs利用的胞漿機制，對暴露于過量人PMNs（1:10）的ST2細胞進行RNA測序。在加入PMNs后3和24小時收集細胞，根據(jù)目標標簽的存在通過熒光激活細胞分選（FACS）分離（圖2A）。

       主成分分析顯示，早期（3 h）和晚期（24 h）的胞葬細胞之間以及與非胞葬（對照）細胞之間的基因譜存在較大差異（圖2B）。正如預期的那樣，基于其進行胞葬的功能能力，MSCs甚至在胞葬攻擊之前就表達許多吞噬和胞葬受體和信號通路的轉錄物（圖2C）。值得注意的是，吞噬和胞葬受體在胞葬后3小時上調（Axl，Tyro3，Itagv等），而降解凋亡貨物所需的內部處理途徑所需的分子轉錄物（例如，Elmo1, Elmo2，Dock1，Gulp1）在24小時上調（圖2C-E）。骨髓來源的原代小鼠MSCs也可以吞噬凋亡的胸腺細胞（圖2F，G）。對暴露于凋亡胸腺細胞（SCAT）的原代小鼠骨髓來源的基質細胞進行轉錄分析，發(fā)現(xiàn)ST2細胞中相同的胞漿途徑（圖2H-J）。這些數(shù)據(jù)確定原代小鼠間充質干細胞的關鍵胞漿介質，并提示無論凋亡靶點如何，類似的機制都被使用。

圖2. MSCs上調胞葬受體通路

2. MSCs胞葬誘導應激反應

       應用基因集富集分析（GSEA）和KEGG數(shù)據(jù)庫的通路分析預測胞葬對MSCs的功能影響。與胞葬行為一致，有轉錄證據(jù)表明參與吞噬體和溶酶體的基因增加（圖3A、B）。此外，該分析確定通過轉錄下調的代謝和生物發(fā)生途徑（圖3C、D）以及參與細胞衰老和凋亡的基因上調（圖3E、F）的MSC整體應激的證據(jù)。為從功能上證實通過通路分析確定的細胞衰老，測定胞漿ST2細胞中β-半乳糖苷酶（β-Gal）和增殖潛能。與非胞葬（PMN-） ST2細胞相比，胞葬（PMN+） ST2細胞的β-Gal活性增加（圖3G）。與細胞衰老增加一致，分選的PMN + ST2細胞的細胞復制減少（圖3H）。因此，這些數(shù)據(jù)表明胞葬誘導MSCs顯著的細胞應激。

圖3. MSCs的胞葬降低代謝基因的表達，增加應激反應基因的表達

3. 間充質基質細胞胞葬破壞成骨細胞和脂肪細胞分化能力

       為測試胞葬對間充質干細胞分化的影響，用胞葬靶點誘導間充質干細胞向成骨細胞和脂肪細胞分化。將ST2細胞以ST2:PMN的比例為1:1,1:2和1:3暴露于PMN中24小時，在去除未被吞噬的PMN后，將ST2細胞暴露于成骨誘導或脂肪誘導的培養(yǎng)基中。盡管在之前的實驗中，24小時只有一部分ST2細胞為PMN+（見圖1B），但通過堿性磷酸酶和Von Kossa染色，與未暴露于PMN的ST2細胞相比，暴露于PMN的ST2細胞降低了成骨細胞分化（圖4A ~ D）。通過FACS分離PMN+和PMN- ST2細胞（圖4E）。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，有胞葬細胞的MSCs （PMN+）的堿性磷酸酶染色減少，而其非胞葬細胞（PMN -）的MSCs的堿性磷酸酶染色令人驚訝地有小幅但顯著的增加，對照組也接受未分離的FACS流體（圖4E-G）。因此，間充質干細胞的胞葬作用在間充質干細胞成骨分化中誘導細胞自主缺陷。與成骨的功能缺陷相一致，胞葬后，正性成骨調節(jié)基因如Osr1、Bmp4、Omd、Igf-1減少，而負性成骨調節(jié)基因如Suv39h1增加（圖4H，紅色突出的特定基因）。與成骨抑制相似，胞葬的間充質干細胞如誘導后脂質空泡形成減少所示，脂肪細胞分化減少（圖5A-F）。與脂肪生成中的功能缺陷一致，陽性的脂肪生成調節(jié)基因，如Cebpa, Cebpg, Srebf1和Fosb在胞葬后減少（圖5G，紅色突出顯示的特定基因）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明胞葬作用通過抑制間充質干細胞分化而破壞間充質干細胞的分化能力，而不是通過從成骨細胞向脂肪細胞分化。

圖4. 終末期中性粒細胞胞葬破壞成骨細胞分化

圖5. 終末期中性粒細胞胞葬破壞脂肪細胞分化

4. 間充質干細胞的胞葬破壞代謝和線粒體網(wǎng)絡

       在胞葬MSCs的轉錄過程中發(fā)現(xiàn)的許多通路與代謝失調相關（圖3C、D）。測定氧消耗率（OCR）和細胞外酸化率（ECR），這兩項分別測定氧化磷酸化和糖酵解。與轉錄數(shù)據(jù)一致，MSCs的胞葬減少氧化磷酸化（圖6A、B）和糖酵解（圖6C、D）。分選PMN+和PMN- MSCs，并測定OCR和ECR，發(fā)現(xiàn)在氧耗和糖酵解方面，最劇烈的代謝紊亂出現(xiàn)在胞葬型（PMN+） MSCs中，而非胞葬型（PMN -） MSCs的糖酵解相對保留（圖6E-H）。這些數(shù)據(jù)表明胞葬顯著改變間充質干細胞的代謝過程。

圖6. 胞葬MSCs的氧化磷酸化和糖酵解被破壞

5. 抑制線粒體分裂減少胞葬并挽救成骨細胞分化障礙

       利用ST2 RNA測序數(shù)據(jù)集探索線粒體動力學基因和通路，發(fā)現(xiàn)胞葬介導的基因動態(tài)調節(jié)與線粒體分裂和融合有關。在胞葬過程的早期（3小時），間充質干細胞上調融合基因，如Mfn2和Opa1（圖7A，藍色標記），然而隨著胞葬過程的進行（24小時），間充質干細胞上調分裂基因，如Fis1和Dmnl1（圖7A，紅色標記）。這些數(shù)據(jù)表明，MSCs在進行胞葬后，從線粒體融合狀態(tài)轉變?yōu)榉至褷顟B(tài)。為證實胞葬MSCs的線粒體重塑，使用MitoTracker Red或TMRE標記對照組和PMN+ MSCs的線粒體，并分別評估線粒體長度和膜電位。發(fā)現(xiàn)胞葬MSCs的線粒體長度（圖7B、C）和TMRE信號（圖7D）降低，與線粒體發(fā)生分裂相一致。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，由于胞葬，MSCs的氧化功能降低，線粒體發(fā)生重塑，這與線粒體發(fā)生分裂的情況一致。

       測試從人骨髓分離的MSCs是具有胞漿功能。人骨髓間充質干細胞（hMSCs）表現(xiàn)出與小鼠骨髓間充質干細胞相似的胞葬率（圖7E、F）。與對小鼠骨髓間充質干細胞的影響相似，胞葬也抑制hMSCs向成骨細胞的分化（圖7K）。在胞葬前用Mdivi（線粒體分裂的抑制劑）處理hMSCs。在使用Mdivi預處理的hMSCs中，在24小時檢測的胞葬的總體速率和效率（MFI）降低，但不影響其活力（圖7G-J）。與線粒體重塑在MSC向成骨細胞分化中的作用一致，在沒有PMN的情況下，Mdivi處理有增加成骨細胞分化的趨勢（圖7K）。重要的是，Mdivi和PMN共同處理可恢復hMSCs的成骨分化潛能（圖7K）。綜上所述，在MSC胞葬過程中抑制線粒體分裂可以挽救胞葬MSC的成骨分化潛能。這些數(shù)據(jù)表明，在MSCs中，線粒體分裂的增加介導胞葬誘導的成骨細胞分化缺陷。

圖7. 胞葬使MSC線粒體趨向分裂

結論

       本研究描述了間充質干細胞作為BMME中的非專業(yè)吞噬細胞的新功能，并證明了間充質干細胞的胞葬作用在指導線粒體重塑和間充質干細胞分化中起關鍵作用。因此，MSCs的胞葬功能可能是一種功能障礙和衰老的新機制。由于人類間充質干細胞的數(shù)據(jù)表明，間充質干細胞胞葬是保守的，因此，MSC胞葬的結果可能會影響這些細胞在人類骨骼中的行為，包括在衰老、癌癥和其他疾病背景下的骨髓重塑和骨丟失。

實驗方法

體外胞葬分析，共聚焦顯微技術，RNA 測序，生物能量學分析，線粒體網(wǎng)絡測量，線粒體膜電位測量，分化實驗，BODIPY染色，堿性磷酸酶和Von Kossa染色，光顯微鏡，藥物抑制線粒體分裂的胞葬分析，藥物抑制線粒體分裂的堿性磷酸酶測定，流式細胞術

參考文獻

Quarato ER, Salama NA, Li AJ, Smith CO, Zhang J, Kawano Y, McArthur M, Liesveld JL, Becker MW, Elliott MR, Eliseev RA, Calvi LM. Efferocytosis by bone marrow mesenchymal stromal cells disrupts osteoblastic differentiation via mitochondrial remodeling. Cell Death Dis. 2023 Jul 14;14(7):428. doi: 10.1038/s41419-023-05931-9. PMID: 37452070; PMCID: PMC10349065.