USP1通過(guò)去泛素化PARP1來(lái)阻止其蛋白酶體降解，從而促進(jìn)膽管癌的發(fā)展

       盡管去泛素酶USP1（泛素特異性蛋白酶1）參與了多種癌癥的治療，但它在膽管癌（CCA）中的功能尚未得到研究。在本研究中，作者提供了USP1通過(guò)穩(wěn)定聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）促進(jìn)CCA進(jìn)展的證據(jù)，這與USP1和PARP1在人類 CCA中均上調(diào)的觀察結(jié)果一致。對(duì)表達(dá)USP1的CCA細(xì)胞進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)和泛素組分析發(fā)現(xiàn)，PARP1是USP1的主要底物。事實(shí)上，通過(guò)一系列免疫熒光、共免疫沉淀（CO-IP）和GST牽引試驗(yàn)驗(yàn)證了它們的直接相互作用，并利用缺失突變體確定了它們的相互作用區(qū)域。從機(jī)理上講，USP1清除了PARP1 K197 處的泛素鏈，阻止了其蛋白酶體降解，從而使PARP1趨于穩(wěn)定，這是促進(jìn)CCA體外和體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件和充分條件。此外，作者還發(fā)現(xiàn)乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5可在K130處對(duì)USP1進(jìn)行乙?；?，從而增強(qiáng)USP1和PARP1之間的親和力，進(jìn)一步提高PARP1蛋白的穩(wěn)定性。最后，USP1和PARP1都與CCA患者的不良生存率密切相關(guān)。這些研究結(jié)果表明，PARP1是USP1的新型去泛素化靶點(diǎn)，也是CCA的潛在治療靶點(diǎn)。本文于2023年10月發(fā)表于《cell death & disease》，IF=9。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. PARP1是CCA中USP1去泛素化酶活性的主要靶標(biāo)

       為了闡明USP1可能參與了CCA的發(fā)生和發(fā)展，作者首先發(fā)現(xiàn)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的鄰近組織相比，USP1在CCA組織中顯著上調(diào)（圖1A）。接下來(lái)，作者建立了過(guò)表達(dá)USP1的穩(wěn)定RBE細(xì)胞系，并進(jìn)行了基于質(zhì)譜儀的總蛋白質(zhì)組學(xué)分析和泛素化特異性蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖1B）。結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果，作者選出了前10個(gè)候選蛋白，并用 IP 檢測(cè)法對(duì)它們進(jìn)行了單獨(dú)檢測(cè)。其中，只有PARP1（圖1C）驗(yàn)證了與USP1的相互作用。PARP1是一種眾所周知的癌癥相關(guān)蛋白，在許多癌癥類型中都會(huì)發(fā)生PTM（翻譯后修飾），因此作者將其作為后續(xù)機(jī)理研究的重點(diǎn)。

       為了進(jìn)一步驗(yàn)證觀察到的USP1-PARP1相互作用，作者在CCA細(xì)胞系HuCC-T1、HCCC-9810、RBE和HEK-293T中進(jìn)行了確證CO-IP試驗(yàn)（圖1D-H）。免疫熒光染色證實(shí)它們主要共定位在細(xì)胞核內(nèi)，一小部分分布在HuCC-T1、HCCC-9810和RBE 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖1I）。為了獲得更高的特異性和靈敏度，作者還使用靶向USP1 和內(nèi)源性PARP1的一抗以及用特異性檢測(cè)寡核苷酸標(biāo)記的二抗進(jìn)行了近距離連接試驗(yàn)（PLA）。作者在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都觀察到了主要的PLA信號(hào)（圖1J），進(jìn)一步支持了USP1-PARP1的直接相互作用。使用重組蛋白GST-USP1或無(wú)催化活性的突變體GST-USP1 C90S進(jìn)行的體外GST牽引實(shí)驗(yàn)表明，兩種純化蛋白都能與Myc-PARP1結(jié)合，而GST本身在無(wú)細(xì)胞條件下不能與Myc-PARP1結(jié)合（圖1K），這表明它們的直接相互作用與USP1的酶活性無(wú)關(guān)。

       為了研究USP1和PARP1之間相互作用的特定區(qū)域，作者生成了這兩種蛋白的截短突變片段（圖1L、M），以確定結(jié)合位點(diǎn)。作者在HEK-293T細(xì)胞中進(jìn)行的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，缺失USP1的201-785和401-785氨基酸會(huì)削弱其與PARP1結(jié)合的能力，而缺失1-200或1-400氨基酸則沒(méi)有影響（圖1N、O），這表明PARP1結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域在USP1的401-785氨基酸之間。對(duì)PARP1而言，缺失203-1014氨基酸就會(huì)失去與USP1的結(jié)合，而缺失1-203氨基酸或一系列C端截?cái)鄤t會(huì)保留結(jié)合，包括缺失476-1014氨基酸；這些措施一起將與USP1結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域縮小到了PARP1的203-476氨基酸（圖1P），該區(qū)域包含已知的介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用的BRCT結(jié)構(gòu)域。這些實(shí)驗(yàn)劃定了每種蛋白質(zhì)的關(guān)鍵相互結(jié)合區(qū)域。

圖 1：USP1與PARP1相互作用

2. USP1阻止PARP1蛋白降解

       為了驗(yàn)證USP1通過(guò)阻止PARP1降解直接穩(wěn)定PARP1的假設(shè)，作者首先在HEK-293T細(xì)胞中以兩種劑量水平過(guò)表達(dá)USP1，并觀察到PARP1蛋白水平出現(xiàn)了相應(yīng)的梯度增加（圖2A）。在CCA細(xì)胞系中，敲除USP1導(dǎo)致PARP1蛋白水平下降，而 USP1過(guò)表達(dá)則產(chǎn)生相反的效果。接著，作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132逆轉(zhuǎn)了USP1 敲除導(dǎo)致的PARP1蛋白水平的降低，但沒(méi)有逆轉(zhuǎn)USP1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的PARP1蛋白水平的升高（圖2B-D）。相比之下，自噬體途徑抑制劑CQ未能逆轉(zhuǎn)USP1敲除對(duì)PARP1 的影響（圖2B）。通過(guò)qRT-PCR分析，作者觀察到USP1敲除或過(guò)表達(dá)對(duì)PARP1的 mRNA水平?jīng)]有任何顯著影響（圖2E、F）

       接著，作者發(fā)現(xiàn)USP1敲除介導(dǎo)的PARP1蛋白減少在過(guò)表達(dá)USP1后幾乎完全恢復(fù)，但催化活性不高的突變體USP1 C90S則不能（圖2G-I）。最后，作者給過(guò)表達(dá) USP1或USP1 C90S的RBE細(xì)胞施用蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX。只有過(guò)表達(dá)野生型 USP1才能阻止PARP1蛋白降解（圖2J-K）。此外，在HuCC-T1和HCCC-9810細(xì)胞中，CHX 處理同樣會(huì)降低PARP1蛋白水平，而敲除USP1會(huì)進(jìn)一步加劇這種情況（圖2L-O）。綜上所述，這些結(jié)果表明USP1通過(guò)防止蛋白體降解對(duì)PARP1進(jìn)行翻譯后調(diào)控，而這需要USP1的催化活性。

圖 2：USP1可增強(qiáng)PARP1的穩(wěn)定性。

3. USP1 通過(guò)去泛素化防止PARP1降解

       作者觀察到，在HuCC-T1和HCCC-9810細(xì)胞中敲除USP1后，PARP1的內(nèi)源性泛素化水平增加（圖3A），這與USP1在CCA中直接去泛素化PARP1的情況一致。相反，轉(zhuǎn)染HA-USP1而非HA-USP1 C90S會(huì)導(dǎo)致HEK-293T和RBE細(xì)胞中外源性 PARP1泛素化水平下降（圖3B）。此外，隨著USP1用量的增加，PARP1的泛素化水平同樣進(jìn)一步下降（圖3C）。為了確定PARP1是否是USP1直接去泛素化的底物，作者在無(wú)細(xì)胞條件下將多泛素化的PARP1與純化的HA-USP1或HA-USP1 C90S共同結(jié)合。HA-USP1而不是HA-USP1 C90S 能特異性地去除PARP1的多泛素化鏈（圖 3D）。這些結(jié)果共同證實(shí)了USP1可直接去泛素 PARP1。

       為了確定USP1靶向的PARP1賴氨酸位點(diǎn)，作者對(duì)泛素化特異性質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了全面分析，觀察到Lys-197可能是USP1對(duì)PARP1進(jìn)行去泛素化的重要位點(diǎn)（圖3E）。作者還發(fā)現(xiàn)，USP1并沒(méi)有對(duì)PARP1-K197R進(jìn)行泛素化（圖3F）。這表明K197 位點(diǎn)是控制PARP1降解的主要USP1泛素化靶點(diǎn)。

       通過(guò)使用特定的泛素突變體，作者確定USP1能有效地裂解與lys48鏈接的 PARP1多泛素化，但不能裂解與lys63鏈接的PARP1多泛素化（圖3G）。此外，USP1對(duì)與 lys6、lys11、lys27、lys29 和 lys33 連接的PARP1的泛素化影響不大（圖3H）。在以泛素鏈為底物的體內(nèi)二泛素化形成實(shí)驗(yàn)中，作者觀察到USP1能夠裂解K48鏈接的二泛素（圖3I）?？傊?，這些研究結(jié)果表明，USP1可作為一種針對(duì)PARP1上K197的去泛素化酶發(fā)揮作用。

圖 3：USP1清除PARP1的K197上與K48鏈接的泛素鏈

4. USP1通過(guò)穩(wěn)定PARP1促進(jìn)CCA的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移

       為了評(píng)估USP1介導(dǎo)的PARP1調(diào)節(jié)對(duì)CCA表型的功能影響，作者首先在HuCC-T1和HCCC-9810細(xì)胞中沉默USP1，結(jié)果體外細(xì)胞增殖受到抑制。相反，上調(diào)USP1 會(huì)增加RBE細(xì)胞的增殖。重要的是，這兩種效應(yīng)可分別通過(guò)過(guò)表達(dá)或敲除PARP1而逆轉(zhuǎn)（圖4A-C）。此外，抑制USP1會(huì)阻礙HCCC-9810和HuCC-T1的侵襲，而上調(diào) USP1會(huì)促進(jìn)RBE細(xì)胞系的侵襲。同樣，通過(guò)調(diào)節(jié) PARP1 的表達(dá)也可以逆轉(zhuǎn)這些情況（圖4D-G）。

       接下來(lái)，作者發(fā)現(xiàn)敲除USP1會(huì)阻礙HuCC-T1異種移植物的體內(nèi)生長(zhǎng)，而USP1 的過(guò)表達(dá)則會(huì)促進(jìn)RBE異種移植物的生長(zhǎng)。與體外實(shí)驗(yàn)類似，這兩種結(jié)果也可分別通過(guò)過(guò)表達(dá)或敲除PARP1而逆轉(zhuǎn)（圖4H-M）。此外，使用實(shí)驗(yàn)性尾靜脈肺轉(zhuǎn)移方案，USP1 基因敲除導(dǎo)致轉(zhuǎn)移數(shù)量減少，而USP1基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移數(shù)量增加，這同樣分別取決于PARP1基因過(guò)表達(dá)或基因敲除（圖4N，Q）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明 USP1 主要通過(guò)PARP1在體外和體內(nèi)促進(jìn)CCA的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖 4：USP1通過(guò)PARP1促進(jìn)CCA增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移

5. GCN5可誘導(dǎo)USP1發(fā)生乙?；?，從而增強(qiáng)PARP1的穩(wěn)定性

       作者接下來(lái)詢問(wèn)USP1本身是否受PTM調(diào)節(jié)。在研究了蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù) PhosphoSitePlus 之后，作者發(fā)現(xiàn)USP1具有多個(gè)乙?；稽c(diǎn)，包括在不同物種中高度保守的K130（圖5A）。用去乙?；敢种苿═SA/NAM）處理后，IP分析顯示在 HuCC-T1和HCCC-9810中USP1的乙?；@著增加（圖5B）。一般來(lái)說(shuō)，包括 P300、GCN5、PCAF、CBP和Tip60在內(nèi)的五種乙酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)了真核生物中約90%的蛋白質(zhì)乙?；?。使用所有5種乙酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的系統(tǒng)IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GCN5是HEK-293T細(xì)胞中與USP1僅有的相互作用者（圖5C）。這種直接相互作用在CCA細(xì)胞中通過(guò)IP 和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)得到了證實(shí)（圖5D、E）。

       接下來(lái)，作者在HEK-293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GCN5，觀察到USP1乙酰化增加，而用GCN5抑制劑MB-3處理則會(huì)減少USP1乙?；▓D5F）。作者通過(guò)創(chuàng)建不可乙?；腢SP1-K130R突變體，進(jìn)一步關(guān)注USP1上的K130位點(diǎn)。值得注意的是，在過(guò)表達(dá)GCN5時(shí)，HEK-293T細(xì)胞中USP1-K130R突變體的整體乙酰化水平并沒(méi)有增加（圖5G）。與此相一致的是，在HEK-293T和RBE細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)乙?；鶖M態(tài) K130Q USP1時(shí)，與野生型USP1相比，USP1 K130Q與PARP1之間的親和力更強(qiáng)，PARP1 蛋白水平的增加也更明顯（圖5H，I），這表明K130乙?；瘜?duì)USP1的功能有正向調(diào)節(jié)作用。然后作者發(fā)現(xiàn)，與野生型USP1相比，USP1 K130R的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致PARP1泛素化的增加（圖5J）。反之亦然，過(guò)表達(dá)USP1 K130Q會(huì)導(dǎo)致PARP1泛素化程度降低（圖5K）。此外，在HEK-293T和RBE細(xì)胞中，GCN5的共重表達(dá)增強(qiáng)了USP1 過(guò)表達(dá)對(duì)PARP1去泛素化的影響（圖5L）。最后，利用CHX蛋白合成抑制試驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)與野生型USP1相比，在RBE中過(guò)表達(dá)USP1 K130Q能顯著提高內(nèi)源性 PARP1蛋白水平的穩(wěn)定性（圖5M，N）。同樣，GCN5與USP1共重表達(dá)也增強(qiáng)了PARP1蛋白水平的穩(wěn)定性（圖5O，P）?？傊髡叩难芯拷Y(jié)果確定了GCN5是主要的USP1乙酰化酶，其作用是將PARP1和USP1結(jié)合在一起。

圖 5：GCN5誘導(dǎo)USP1乙?；约訌?qiáng)PARP1的穩(wěn)定性

6. USP1與PARP1在CCA患者中的表達(dá)相關(guān)

       為了評(píng)估USP1-PARP1軸在CCA中的臨床意義，作者首先研究了人類CCA樣本中USP1和PARP1蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。通過(guò)免疫印跡分析，作者觀察到CCA樣本中USP1和PARP1蛋白水平呈正相關(guān)（n = 28，P < 0.0001，Pearson r = 0.3118）（圖 6A、B）。隨后，對(duì)CCA樣本（n = 65）進(jìn)行了USP1和PARP1的IHC染色。圖6C 和D展示了USP1和PARP1染色的代表性圖像，這兩種蛋白之間存在顯著的正相關(guān)性（Pearson r = 0.0002，P = 0.1987）。Kaplan-Meier 生存分析（n = 65）表明，USP1 或PARP1表達(dá)上調(diào)與總生存期縮短之間存在顯著相關(guān)性（圖6E、F）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，USP1在CCA患者中調(diào)控 PARP1，而兩者都與不利的預(yù)后顯著相關(guān)。圖 6G 顯示了本研究的總體設(shè)計(jì)，它表明GCN5在K130處乙?；疷SP1，增強(qiáng)了USP1和 PARP1之間的親和力，進(jìn)一步提高了PARP1蛋白的穩(wěn)定性。

圖 6：USP1在CCA組織中富集，其表達(dá)與患者的存活率呈負(fù)相關(guān)

結(jié)論

       總之，作者的研究結(jié)果表明，USP1作為一種去泛素化酶，通過(guò)對(duì)抗PARP1泛素化介導(dǎo)的降解來(lái)調(diào)節(jié)CCA的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，作者還證明這一調(diào)控機(jī)制受GCN5 對(duì)USP1乙?；癄顟B(tài)的影響。GCN5-USP1-PARP1軸為乙酰轉(zhuǎn)移酶和去泛素化酶在 CCA發(fā)病機(jī)制中的作用提供了新的見(jiàn)解，并可能為開(kāi)發(fā)針對(duì)這種致命疾病的更好的靶向療法鋪平道路。

常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)

免疫印跡、qRT-PCR、免疫組織化學(xué)、免疫熒光、免疫共沉淀、GST下拉試驗(yàn)、體內(nèi)和體外去泛素化測(cè)定、質(zhì)譜

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒感染、 跨孔檢測(cè)、細(xì)胞克隆檢測(cè)、細(xì)胞凋亡測(cè)定、

動(dòng)物模型及病理實(shí)驗(yàn)

鄰位連接試驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)

Zhang, D.Y., Zhu, Y., Wu, Q. et al. USP1 promotes cholangiocarcinoma progression by deubiquitinating PARP1 to prevent its proteasomal degradation. Cell Death Dis 14, 669 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-06172-6