西諾明通過乳酸桿菌的色氨酸代謝物改善關(guān)節(jié)炎

       腸道微生物群失調(diào)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的發(fā)病有關(guān)。西諾明（SIN）是一種用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效免疫抑制和抗炎藥物，但 SIN 如何調(diào)節(jié)腸道微生物群以緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎仍未得到充分探索。為確定與SIN的RA保護(hù)作用相關(guān)的關(guān)鍵腸道微生物物種和微生物代謝產(chǎn)物，研究人員通過16S rRNA基因測序、抗生素治療和糞便微生物群移植評估了SIN的微生物群依賴性抗RA作用。通過代謝組學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄分析和靶向細(xì)菌/代謝物灌胃，探討了SIN如何調(diào)節(jié)腸道微生物群以減輕RA的嚴(yán)重程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIN 主要通過調(diào)節(jié)Lactobacillus乳酸桿菌的豐度來恢復(fù)腸道微生物平衡，并以腸道微生物群依賴的方式顯著緩解膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）癥狀。SIN 能明顯提高微生物色氨酸代謝物吲哚-3-丙烯酸（IA）、IPA和吲哚-3-乙酸（IAA）的含量。補(bǔ)充色氨酸代謝物可激活芳基烴受體（AhR）并調(diào)節(jié) CIA 大鼠 Th17/Treg 的平衡。耐人尋味的是，SIN 能緩解關(guān)節(jié)炎癥狀，這與兩種有益的抗 CIA 乳酸桿菌（L. paracasei副干酪乳酸桿菌和L. casei干酪乳酸桿菌）的單菌落富集有關(guān)。SIN 的治療功能很有希望，這主要?dú)w功于通過明確靶向乳酸桿菌和微生物色氨酸代謝物激活了 AhR。腸道細(xì)菌 L. paracasei 和 L. casei 可用于減輕 CIA 的嚴(yán)重程度。

       本文于2023年7月發(fā)表在《Science Bulletin (Beijing)》IF：18.9期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、SIN減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度

       為評估SIN對RA的影響，CIA大鼠分別給予對照、SIN或甲氨蝶呤，然后檢查關(guān)節(jié)炎相關(guān)特征。與CIA大鼠相比，給予SIN的大鼠體重減輕（圖1a），腳掌腫脹減輕（圖1b），關(guān)節(jié)炎評分降低（圖1c）。H&E染色顯示，與CIA大鼠相比，SIN處理減少了細(xì)胞浸潤和滑膜增生，軟骨侵蝕和滑膜形成減少，關(guān)節(jié)腔更寬（圖1d-f）。值得注意的是，與CIA組相比，SIN給藥顯著降低了血清RF和CCP-Ab水平（圖1g, h）。進(jìn)一步評估了SIN對免疫器官脾臟和胸腺指數(shù)和炎癥因子的影響（圖1i-n）。SIN能明顯降低脾臟和胸腺指數(shù)，降低IL-6、TNF-α和IFNG水平，增加IL-4。還觀察到，隨著劑量從 30 mg/kg增加到 240 mg/kg，SIN 能有效減輕 CIA 的嚴(yán)重程度。SIN 對 CIA 的保護(hù)作用與陽性對照甲氨蝶呤相當(dāng)。這些結(jié)果證明，SIN 能有效改善大鼠模型中的 CIA。

圖1 SIN可減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度

2、SIN可逆轉(zhuǎn)CIA大鼠腸道生態(tài)失調(diào)

       鑒于腸道微生物群對 RA 的發(fā)病有一定的影響，接下來通過對實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)糞便樣本進(jìn)行 16S rRNA 基因測序，研究了 SIN 對腸道微生物群組成的影響。與 CIA 組相比，SIN 明顯降低了 Chao 指數(shù)（圖 2a）和 Shannon 指數(shù)（圖 2b），這表明 SIN 可降低 CIA 大鼠升高的 alpha 多樣性，而 alpha 多樣性可通過物種豐富度和物種均勻度反映群落多樣性?；?UniFrac 的主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示了各組微生物群組成的不同聚類（圖 2c）。接下來比較 CIA 模型和 SIN 處理所改變的特定菌屬。通過 Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)選出了對照組、CIA 模型組和 SIN 組中差異顯著的 57 個(gè)細(xì)菌屬，并進(jìn)一步利用豐度前 50 的細(xì)菌屬確定了 SIN 改變的特定細(xì)菌系統(tǒng)型（圖 2d）。熱圖分析表明，經(jīng)過 SIN 處理后，腸道微生物群的組成發(fā)生了重大改變。與對照組大鼠相比，經(jīng) Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，CIA 大鼠的 29 個(gè)菌屬（28 個(gè)增加，1 個(gè)減少）發(fā)生了顯著變化，而補(bǔ)充 SIN 后，47 個(gè)菌屬（11 個(gè)增加，36 個(gè)減少）發(fā)生了變化，并表現(xiàn)出向更健康的方向轉(zhuǎn)變。

       與 CIA 組相比，相對豐度較高的細(xì)菌屬（乳酸桿菌 > Romboutsia > Norank_f_ Muribaculaceae > Allobaculum > Clostridium_sensu_stricto_1）都受到 SIN 施用的顯著調(diào)節(jié)（圖 2e）。值得注意的是，冗余分析（RDA）表明乳酸桿菌與CIA相關(guān)指標(biāo)（爪體積、TNF-α、RF和CCP-Ab）的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，這表明乳酸桿菌的富集可能參與了SIN對CIA的保護(hù)作用（圖2f）。SIN治療后腸道屏障的改善表現(xiàn)在Zonula occluden-1（ZO-1）、occludin、claudin-1和claudin-2的mRNA表達(dá)增加（圖2g），這表明SIN可以改善腸道屏障功能障礙并減輕結(jié)腸損傷（圖2h）。

圖2 SIN改善CIA大鼠腸道菌群失調(diào)

3、SIN以腸道微生物依賴的方式減輕CIA

       為驗(yàn)證 SIN 對 CIA 大鼠的保護(hù)作用是由腸道微生物群介導(dǎo)的，將 SIN 處理過的 CIA 大鼠的微生物群通過每天灌胃的方式移植給 CIA 受體大鼠（圖 3a）。與接受 CIA 供體大鼠腸道微生物群的 CIA 受體大鼠相比，接受 SIN 處理過的 CIA 供體大鼠腸道微生物群的 CIA 受體大鼠的 CIA 相關(guān)癥狀明顯減輕（圖 3b-d），如爪子腫脹減輕、關(guān)節(jié)炎評分降低。這些變化伴隨著踝關(guān)節(jié)和滑膜組織病變的改善（圖 3e-g）、血清學(xué)標(biāo)記物的減少（圖 3h，i）、免疫器官指數(shù)的降低（圖 3j，k）和炎癥細(xì)胞因子水平的下降（圖 3l，m），表明 SIN 處理的 CIA 供體大鼠糞便微生物群對 CIA 具有與 SIN 處理組相似的改善作用。簡而言之，SIN治療產(chǎn)生的改善效果是通過腸道微生物群轉(zhuǎn)移的。

圖3 SIN對CIA大鼠的有益作用是通過FMT轉(zhuǎn)移

4、SIN顯著增加CIA大鼠的色氨酸代謝物

       越來越多的證據(jù)表明，代謝組與 RA 的分子發(fā)病機(jī)制有關(guān)。為研究 SIN 對 CIA 大鼠的保護(hù)作用是否與代謝組變化有關(guān)，對血清和糞便樣本進(jìn)行了非靶向代謝組分析。主成分分析表明，三組大鼠的糞便和血清代謝組明顯不同（圖 4a）。糞便和血清代謝組中分別有67和169個(gè)代謝物的VIP值大于1和P < 0.05。在糞便代謝組中，與對照組相比，CIA 大鼠 67 個(gè)代謝物中有 36 個(gè)（53.7%）的豐度有顯著差異（圖 4b；14 個(gè)上調(diào)，22 個(gè)下調(diào)），而 SIN 處理則顯著逆轉(zhuǎn)了 67 個(gè)代謝物中的 21 個(gè)（31.3%）（圖 4c；15 個(gè)上調(diào)，6 個(gè)下調(diào)）。值得注意的是，服用 SIN 可部分逆轉(zhuǎn) CIA 誘導(dǎo)的代謝物變化（15 個(gè)上調(diào)，29 個(gè)下調(diào)），使大鼠糞便和血清代謝組與對照組相似（圖 4d）。其中，10 個(gè)代謝物在結(jié)構(gòu)上被鑒定為色氨酸代謝物，如 IA、IPA 和 IAA。這些結(jié)果表明，SIN 能顯著調(diào)節(jié) CIA 大鼠腸道色氨酸代謝物。

       作者還通過Spearman’s相關(guān)性分析研究了關(guān)節(jié)炎主要參數(shù)（爪腫、TNF-α、RF 和 CCP-Ab）與不同代謝物變化之間的相關(guān)性。色氨酸代謝物IPA、色氨酸、IA、吲哚-3-甲醛和IAA在SIN治療組大鼠中上調(diào)，并與CIA特征呈負(fù)相關(guān)；而吲哚-4-甲醛、5-羥基吲哚乙酸、5-羥基吲哚、3-吲哚硫酸和5-羥基色氨酸在SIN治療組大鼠中顯著下降，并與CIA特征呈正相關(guān)（圖4d）。由于包括 IA、IAA、IPA、IAM 和 KYN 在內(nèi)的代謝物是腸道微生物色氨酸代謝的產(chǎn)物（圖 4e），接下來作者進(jìn)行了靶向代謝組學(xué)研究，通過 UHPLC-QQQ/MS 測定糞便樣本中色氨酸和 5 種色氨酸代謝物（IA、IAA、IPA、IAM 和 KYN）的豐度。與對照組相比，CIA 大鼠糞便中的色氨酸、IA、IAA 和 TRY 含量明顯降低，而服用 SIN 后，對照組大鼠糞便中的色氨酸、IA、IAA 和 TRY 含量明顯升高（圖 4f-k）。這些結(jié)果表明，SIN 能顯著豐富 CIA 大鼠腸道微生物群衍生的色氨酸代謝物。

圖4 SIN顯著增加CIA大鼠的色氨酸代謝物

5、微生物色氨酸代謝物對大鼠具有抗CIA作用

       為研究 SIN 誘導(dǎo)的色氨酸代謝物富集是否取決于腸道微生物群，作者使用抗生素抑制了腸道微生物群，并通過 FMT 水平轉(zhuǎn)移了 SIN 處理過的 CIA 大鼠的糞便，然后測定了色氨酸代謝物的水平。不僅上述 SIN 的保護(hù)作用減弱，還發(fā)現(xiàn)抗生素治療消除了血清和糞便樣本中的色氨酸代謝物，如 IA、IAA 和 IPA（圖4f-k）。

       作者還發(fā)現(xiàn)，色氨酸代謝物 IA、IAA 和 IPA 與 CIA 相關(guān)指標(biāo)呈較高的正相關(guān)性（圖 5a）。這些結(jié)果促使作者研究色氨酸代謝物是否能在大鼠模型中產(chǎn)生抗 CIA 作用。與 CIA 大鼠相比，Try-M 能顯著減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，如體重減輕、爪腫減輕和關(guān)節(jié)炎評分降低（圖 5b-d），同時(shí)細(xì)胞浸潤和增生滑膜減少（圖 5e-g），血清 RF 和 CCP-Ab 降低，脾臟和胸腺指數(shù)降低（圖 5h-k）。色氨酸代謝物大大提高了 IL-10 的水平，降低了 IL-6、TNF-α 和 IL-17 的水平，從而緩解了炎癥（圖 5l-o）。此外，色氨酸代謝物還能改善腸道屏障功能，減輕結(jié)腸損傷（圖 5p，q）。

圖5 微生物色氨酸代謝物對大鼠具有抗CIA作用

6、SIN激活A(yù)hR通路減弱大鼠CIA

       為探討SIN對CIA保護(hù)作用的機(jī)制，通過RNA-Seq分析了滑膜基因的表達(dá)譜。共獲得3171個(gè)DEGs，Spearman相關(guān)性表明，基因IL-17、RORγt、NFKBIA和MAPK14與CIA相關(guān)指標(biāo)的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而Foxp3、CYP1A1和AhR與CIA特征呈負(fù)相關(guān)（圖6a）。與 RNA-seq 分析一致，qPCR 檢測表明 SIN 顯著降低了滑膜IL-17 和 RORγt 的 mRNA 水平，提高了 AhR、CYP1A1、Foxp3 和 IL-10 的 mRNA 水平（圖 6b）。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步研究了滑液中 Th17 和 Treg 細(xì)胞之間的失衡。結(jié)果表明，與模型組相比，Try-M 和 SIN 能顯著降低滑膜 Th17 細(xì)胞的比例（圖 6c）。同樣，Try-M 和 SIN 也能大大提高滑膜 Treg 細(xì)胞的比例（圖 6d）。SIN和Try-M都是AhR的配體，可通過激活A(yù)hR逆轉(zhuǎn)CIA大鼠體內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞的失衡。

       在CIA的發(fā)病過程中，AhR的激活會通過調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK磷酸化影響炎癥和免疫反應(yīng)。為了證實(shí) SIN 對 Th17/Treg 平衡的調(diào)節(jié)是否是由 AhR 激活通過調(diào)節(jié) NF-κB 和 MAPK 通路觸發(fā)的，作者進(jìn)一步測定了滑膜中 AhR 信號、NF-κB 和 MAPK 磷酸化蛋白的表達(dá)。Western印跡分析表明，SIN或Try-M能顯著降低p-p38和p-p65的蛋白水平，而SIN或Try-M能顯著增強(qiáng)滑膜中AhR和CYP1A1的表達(dá)（圖6e），表明SIN和Try-M能通過激活A(yù)hR來調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK的磷酸化，從而減輕CIA。

圖6 SIN激活A(yù)hR通路減弱大鼠CIA

7、SIN激活A(yù)hR通路以減弱MH7A細(xì)胞中的RA

       SPR 分析表明，IAA 與 AhR 具有良好的結(jié)合親和力，估計(jì)的平衡解離常數(shù)為 2.15 × 10-8 mol/L（圖 7a）。使用 AutoDock 驗(yàn)證了 AhR 與這三種色氨酸代謝物之間潛在的相互作用。結(jié)果表明，IAA、IA和IPA可以通過氫鍵、疏水作用和π-堆積與AhR結(jié)合。從親和力值來看，這三種色氨酸代謝物明顯能與 AhR 結(jié)合。同時(shí)，通過 AutoDock，SIN 也能有效地作用于 AhR（圖 7b）。

       為研究SIN和Try-M激活A(yù)hR的潛在作用，使用AhR siRNA轉(zhuǎn)染建立了TNF-α誘導(dǎo)的MH7A特異性AhR敲除細(xì)胞模型。結(jié)果表明，在 AhR 缺失的 MH7A 細(xì)胞中，SIN 和 Try-M 對 TNF-α 誘導(dǎo)的 Th17/Treg 失衡和炎癥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用減弱（圖 7c）。此外，在 AhR 缺乏的 MH7A 細(xì)胞中，SIN 和 Try-M 對 p-p38、p-p65、AhR 和 CYP1A1 蛋白表達(dá)的影響也減弱了（圖 7d,e）。這些結(jié)果表明，在 TNF-α 誘導(dǎo)的 RA MH7A 細(xì)胞模型中，AhR 敲除或抑制減弱了 SIN 和 Try-M 的調(diào)節(jié)作用，這表明 SIN 和 Try-M 是以一種依賴 AhR 的方式調(diào)節(jié) NF-κB 和 MAPK 磷酸化的。

圖7 SIN激活A(yù)hR通路以減弱MH7A細(xì)胞中的RA

8、SIN介導(dǎo)的副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌的富集通過調(diào)節(jié)色氨酸代謝來減弱CIA

       聯(lián)合分析顯示乳酸菌與糞便樣品中包括IA、IAA、IPA、KYN在內(nèi)的Try-M水平呈正相關(guān)（圖8a）。接下來探討了副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌與 CIA 之間可能存在的因果關(guān)系。作者每天給CIA大鼠灌胃副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌，持續(xù)4周，然后檢查CIA相關(guān)指標(biāo)（圖8b）。與CIA大鼠相比，口服副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌能顯著減輕爪腫脹和關(guān)節(jié)炎評分，降低RF和CCP-Ab水平，以及炎性細(xì)胞因子、免疫器官指數(shù)、踝關(guān)節(jié)和滑膜組織病變（圖8c-l）。值得注意的是，與模型組相比，副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌治療可調(diào)節(jié)滑膜的 AhR 和 Th17/Treg 相關(guān)基因，包括 AhR、CYP1A1、Foxp3、IL-10、IL-17 和 RORγt（圖 8m）。重要的是，灌胃副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌的 CIA 大鼠體內(nèi)色氨酸和糞便中來自微生物色氨酸代謝的吲哚衍生物（IA、IAA、IPA）的濃度明顯更高（圖 8n-s）。這些研究結(jié)果表明，SIN 可以顯著富集兩種有益的乳酸桿菌--副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌，它們能夠通過調(diào)節(jié)色氨酸代謝和激活 AhR 來降低 CIA 大鼠的 RA。 

圖8 SIN富集L. paracasei（副干酪乳桿菌）和L. casei（干酪乳桿菌），通過調(diào)節(jié)色氨酸代謝物來減弱CIA

       總之，SIN 能以腸道微生物群依賴的方式顯著緩解 RA 的關(guān)節(jié)損傷和炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，SIN 可改善微生物失衡和腸道屏障功能障礙，并顯著豐富腸道微生物群衍生的色氨酸代謝物（IA、IAA 和 IPA）。給 CIA 大鼠補(bǔ)充色氨酸代謝物可通過激活 AhR 來調(diào)節(jié) NF-κB 和 MAPK 磷酸化，從而減輕與 RA 相關(guān)的炎癥和免疫反應(yīng)。此外，SIN 還能緩解關(guān)節(jié)炎癥狀，其富含的兩種有益乳酸桿菌（L. paracasei 和 L. casei）能減輕 RA 癥狀，而這兩種乳酸桿菌是由單菌落群顯示的。目前的研究提出了 SIN 對 RA 具有保護(hù)作用的新機(jī)制，這些數(shù)據(jù)可能會通過靶向關(guān)鍵代謝物或細(xì)菌為 RA 提供一種有前景的治療方法。

圖9 圖像摘要

實(shí)驗(yàn)方法

關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型構(gòu)建，免疫器官指數(shù)，細(xì)胞因子檢測，組織病理學(xué)分析，色氨酸代謝物（Try-M）對大鼠干預(yù)研究，糞便微生物移植（FMT），細(xì)胞培養(yǎng)和處理，表面等離子體共振（SPR）結(jié)合與分子對接實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)，乳酸桿菌處理大鼠，代謝組，色氨酸代謝物靶向定量，腸道微生物組，Real-time PCR，WB

參考文獻(xiàn)

Jiang ZM, Zeng SL, Huang TQ, Lin Y, Wang FF, Gao XJ, Li J, Li P, Liu EH. Sinomenine ameliorates rheumatoid arthritis by modulating tryptophan metabolism and activating aryl hydrocarbon receptor via gut microbiota regulation. Sci Bull (Beijing). 2023 Jul 30;68(14):1540-1555. doi: 10.1016/j.scib.2023.06.027. Epub 2023 Jun 28. PMID: 37422372.