m6A去甲基化酶FTO通過MCM3介導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)展和HIF-1α激活穩(wěn)定LINK-A發(fā)揮致癌作用

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-04-26
食管癌是一種高度惡性的腫瘤,2020年在全球范圍內(nèi)發(fā)病率排名第七,死亡率排名第六......

 

 

 

       食管癌是一種高度惡性的腫瘤,2020年在全球范圍內(nèi)發(fā)病率排名第七,死亡率排名第六。食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是食管癌最常見的組織學(xué)亞型,預(yù)后較差。化療是食管癌的一線治療,尤其是對(duì)于無手術(shù)指征的局部晚期食管癌患者。然而由于化療耐藥,食管癌患者的5年生存率不足20%。因此,探索關(guān)鍵的致癌驅(qū)動(dòng)基因和闡明潛在的相關(guān)分子機(jī)制,以確定食管鱗癌有前景的治療靶點(diǎn)是值得的。N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核生物中最豐富的內(nèi)部RNA修飾,主要發(fā)生于mRNA。非編碼RNA(ncRNA)的m6A修飾也在包括癌癥發(fā)生在內(nèi)的各種生理和病理生物過程中發(fā)揮重要作用。新證據(jù)表明,m6A修飾可在不同情況下發(fā)揮致癌或腫瘤抑制作用。然而,在癌癥進(jìn)展過程中,m6A修飾調(diào)控ncRNA的確切機(jī)制仍然非常模糊。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是一種氧感知轉(zhuǎn)錄因子。氧反應(yīng)性HIF-1α亞基和組成性表達(dá)的HIF-1β亞基相互作用形成異二聚體HIF-1轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞對(duì)低氧的應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。HIF-1α的積累以及HIF-1α介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和葡萄糖代謝限速酶的激活降低了氧化磷酸化的效率,促進(jìn)了糖酵解。雖然有報(bào)道稱HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活可導(dǎo)致癌癥代謝重編程和治療抵抗,但lncRNA在食管鱗癌中調(diào)節(jié)HIF-1α激活的機(jī)制仍不清楚。該研究發(fā)表在《Cell Reports》,IF:9.995

技術(shù)路線

 

 

 

主要研究結(jié)果

1. FTO穩(wěn)定LINK-A并與化療耐藥相關(guān)

       為了研究在食管鱗癌化療耐藥背景下關(guān)鍵lncRNA的m6A修飾,研究者收集了34例接受新輔助化療的食管鱗癌患者的基線樣本(17例化療耐藥和17例化療敏感),然后測(cè)定了兩種主要的m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的mRNA表達(dá)水平。與化學(xué)敏感樣本相比,在化學(xué)耐藥樣本中顯著上調(diào)(圖1A,B)。此外,研究者測(cè)定了FTO在先前建立的親本和化療耐藥ESCC細(xì)胞系中的蛋白水平與相應(yīng)親本細(xì)胞相比,F(xiàn)TO蛋白表達(dá)在兩個(gè)化學(xué)耐藥細(xì)胞系中上調(diào)(圖1C)。與化療耐藥細(xì)胞中FTO表達(dá)上調(diào)一致,m6A斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與親本細(xì)胞相比,化療耐藥細(xì)胞中m6A的總體水平降低(圖1D)。隨后,為了進(jìn)一步識(shí)別FTO調(diào)控的lncRNA,研究者在兩個(gè)食管鱗癌細(xì)胞系中沉默和過表達(dá)FTO,然后測(cè)量了14個(gè)注釋的ncRNA的表達(dá)水平,這些ncRNA先前在化療耐藥的食管鱗癌細(xì)胞系中顯著高于相應(yīng)的親本細(xì)胞系4個(gè)ncRNA(TTLL3、LINC00663、PRSS30P、CETN4P)的表達(dá)低于實(shí)時(shí)熒光定量pcr的檢測(cè)限。在其余的10個(gè)ncRNA中,只有LINK-A在KYSE30和KYSE450細(xì)胞中在FTO敲低后顯著下調(diào),在FTO過表達(dá)后顯著上調(diào)(圖1E,F(xiàn))。

 

 

圖1 FTO穩(wěn)定LINK-A并與化療耐藥相關(guān)

 

       接下來,研究者進(jìn)行了RNA穩(wěn)定性分析,發(fā)現(xiàn)FTO敲低顯著縮短了LINK-A的半衰期,而FTO過表達(dá)穩(wěn)定了LINK-A(圖1G,H)。隨后,研究者用FTO抑制劑FB23-2處理對(duì)照組和過表達(dá)FTO的KYSE30和KYSE450細(xì)胞。FTO過表達(dá)顯著增加了LINK-A的表達(dá)水平,而FB23-2處理則減弱了這一作用(圖1I)。此外,研究者還確定了FTO對(duì)LINK-A的穩(wěn)定是否依賴于其去甲基化酶活性。甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)-qPCR結(jié)果表明,F(xiàn)TO敲低和FB23-2處理均顯著增加,但FTO過表達(dá)降低了LINK-A的m6A水平(圖1J,K)。與這一發(fā)現(xiàn)一致,MeRIP-qPCR結(jié)果顯示,與親本細(xì)胞相比,化療耐藥細(xì)胞中LINK-A的m6A水平顯著降低(圖1L)。實(shí)時(shí)qPCR結(jié)果表明,在KYSE30和KYSE450細(xì)胞中,野生型但未突變的FTO逆轉(zhuǎn)了FTO敲低引起的LINK-A表達(dá)下降(圖1M)。此外,MeRIP-qPCR結(jié)果表明,在FTO沉默的KYSE30和KYSE450細(xì)胞中,野生型FTO轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致LINK-A甲基化水平顯著降低,而這種去甲基化在FTO突變體轉(zhuǎn)導(dǎo)后未發(fā)生(圖1N)。這些結(jié)果表明FTO以m6a依賴的方式穩(wěn)定LINK-A的表達(dá)。

2. LINK-A在食管鱗癌中具有致癌作用

       為了研究LINK-A在食管鱗癌中的作用,研究者通過原位雜交分析了LINK-A在食管鱗癌患者隊(duì)列中的表達(dá)。生存分析表明,高LINK-A表達(dá)與不良預(yù)后強(qiáng)相關(guān)(圖2A)。此外,LINK-A在癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(圖2B)。此外,在GEO數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證了LINK-A在癌組織中的顯著上調(diào)(圖2C)。為了進(jìn)一步評(píng)估LINK-A作為食管鱗癌治療靶點(diǎn)的潛力,研究者使用了體外化療耐藥模型。研究者測(cè)定了長(zhǎng)期誘導(dǎo)化療耐藥的食管鱗癌細(xì)胞(KYSE450/DDP和YES2/DDP)和相應(yīng)親本細(xì)胞(KYSE450和YES2)中的LINK-A表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與親本細(xì)胞相比,化療耐藥細(xì)胞中的LINK-A表達(dá)顯著上調(diào)(2~5倍)(圖2D)。為了確定LINK-A在藥物短期暴露反應(yīng)中的變化,研究者用順鉑(DDP)處理ESCC細(xì)胞不同時(shí)間(0、6、12和24 h)。隨著DDP處理時(shí)間的增加,LINK-A的表達(dá)顯著增加,尤其是在處理24 h后(圖2E)。這些結(jié)果表明,LINK-A可能在化療耐藥的獲得和維持中起著至關(guān)重要的作用。

       最后,異種移植實(shí)驗(yàn)表明,在KYSE450/DDP和KYSE450細(xì)胞中沉默LINK-A顯著延緩了腫瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)了化療敏感性,而在KYSE150細(xì)胞中過表達(dá)LINK-A顯著促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)和對(duì)細(xì)胞毒性化療的耐藥性(圖2F-K)。綜上所述,這些結(jié)果表明,LINK-A在食管鱗癌中起著致癌作用。

 

 

圖2 LINK-A在食管鱗癌中發(fā)揮致癌作用

 

3. LINK-A通過促進(jìn)MCM3與CDK1的相互作用促進(jìn)MCM3磷酸化

       為了進(jìn)一步闡明LINK-A致癌的下游調(diào)控機(jī)制,研究者通過質(zhì)譜分析鑒定了KYSE450和YES2細(xì)胞中LINK-A沉淀的蛋白質(zhì)。在KYSE450和YES2細(xì)胞中分別鑒定出43和14種LINK-A相互作用蛋白,并且在兩個(gè)細(xì)胞系中均鑒定出其中7種相互作用蛋白(圖3A)。在這7個(gè)重疊蛋白中,MCM3已被報(bào)道在細(xì)胞周期進(jìn)程和DNA復(fù)制中發(fā)揮重要作用,但其在食管鱗癌中的詳細(xì)分子機(jī)制,特別是介導(dǎo)癌細(xì)胞增殖和化療耐藥的機(jī)制尚不清楚。接下來,研究者進(jìn)行了RNA pull-down和蛋白質(zhì)印跡,以確認(rèn)MCM3和LINK-A的義鏈而不是反義鏈之間的特異性相互作用(圖3B)。此外,研究者通過RIP-qPCR在KYSE30和KYSE450細(xì)胞中驗(yàn)證了這種相互作用(圖3C)。接下來,研究者探究了LINK-A對(duì)其相互作用蛋白MCM3表達(dá)的影響。敲低或過表達(dá)LINK-A均不影響MCM3的mRNA或蛋白水平(圖3D,E)。值得注意的是,蛋白質(zhì)印跡分析表明,LINK-A顯著促進(jìn)MCM3在Ser112的磷酸化(圖3D,E)。此外,在瞬時(shí)LINK-A過表達(dá)后,MCM3 Ser112的磷酸化水平以劑量依賴的方式增加(圖3F,G)。

 

 

圖3 LINK-A通過促進(jìn)MCM3與CDK1的相互作用促進(jìn)MCM3磷酸化

 

       先前的研究報(bào)道,CDK1在112位絲氨酸磷酸化MCM3,并介導(dǎo)MCM2-7復(fù)合物的組裝和染色質(zhì)裝載然后研究者確定了LINK-A是否通過作為CDK1和MCM3的支架來促進(jìn)MCM3的磷酸化。RNA pull down和隨后的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證實(shí)了KYSE30和KYSE450細(xì)胞中LINK-A和CDK1之間的相互作用(圖3H)。接下來,免疫共沉淀(coIP)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,敲低LINK-A顯著抑制和過表達(dá)LINK-A增加了CDK1和MCM3之間的相互作用(圖3I,J)。鄰近連接實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在體內(nèi),LINK-A促進(jìn)了CDK1和MCM3之間的相互作用(圖3K,L)。此外,研究者使用純化的MCM3和CDK1蛋白在含有LINK-A有義或反義鏈的緩沖液中進(jìn)行了體外pull-down實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,LINK-A有義鏈而非反義鏈的存在促進(jìn)了MCM3和CDK1的體外相互作用(圖3M)。與此一致的是,與相應(yīng)的親本細(xì)胞系相比,MCM3在Ser112的磷酸化以及CDK1和MCM3之間的相互作用在兩種耐藥細(xì)胞系中都增加了(圖3N,O)。

4. 磷酸化MCM3介導(dǎo)了LINK-A的致癌作用

       為了確定LINK-A介導(dǎo)的MCM3磷酸化是否促進(jìn)MCM復(fù)合物的組裝和隨后的染色質(zhì)加載,研究者進(jìn)行了細(xì)胞分離,然后通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)染色質(zhì)結(jié)合蛋白。在ESCC細(xì)胞中,敲低LINK-A顯著降低MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6和MCM7蛋白的染色質(zhì)負(fù)荷,而過表達(dá)LINK-A促進(jìn)MCM2-7復(fù)合體的染色質(zhì)負(fù)荷(圖4A,B)。接下來,研究者構(gòu)建了MCM3的Ser112位點(diǎn)突變體(MCM3S112A;Ser112突變?yōu)楸彼幔⒁吧蚆CM3和MCM3S112A轉(zhuǎn)染至去除內(nèi)源性MCM3的細(xì)胞中。由LINK-A介導(dǎo)的MCM2-7復(fù)合物的染色質(zhì)負(fù)荷增加被Ser112突變所消除,表明這一過程依賴于MCM3的磷酸化(圖4C)。為了確定MCM3是否介導(dǎo)了LINK-A對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展的促進(jìn)作用,研究者進(jìn)行了挽救試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)野生型MCM3的過表達(dá)完全挽救了LINK-A沉默介導(dǎo)的G0/G1期阻滯,而MCM3S112A沒有(圖4D)。相反,在LINK-A過表達(dá)的KYSE410細(xì)胞中沉默MCM3可抑制LINK-A介導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)展(圖4E)。此外,IncuCyte活細(xì)胞成像分析表明,野生型MCM3而不是MCM3S112A介導(dǎo)了LINK-A對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(圖4F,G)。為了進(jìn)一步證明體內(nèi)MCM3和LINK-A之間的功能關(guān)系,研究者使用KYSE150細(xì)胞進(jìn)行了異種移植實(shí)驗(yàn)。過表達(dá)LINK-A顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和化療耐藥性,而沉默MCM3則消除了這些作用(圖4H,I)。綜上所述,這些結(jié)果表明,LINK-A通過增加MCM3磷酸化來促進(jìn)MCM2-7復(fù)合體的組裝和隨后的染色質(zhì)加載,從而發(fā)揮致癌作用。

 

 

圖4 磷酸化的MCM3介導(dǎo)了LINK-A的致癌作用

 

5. LINK-A通過從MCM3中分離HIF-1α來誘導(dǎo)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性

       為了進(jìn)一步研究LINK-A/MCM3軸導(dǎo)致細(xì)胞毒性化療耐藥性的機(jī)制,研究者在LINK-A沉默的KYSE450細(xì)胞中進(jìn)行了RNA測(cè)序分析。引人注目的是,基因集富集分析表明,與由兩個(gè)獨(dú)立的短發(fā)夾RNA序列中的任何一個(gè)介導(dǎo)的LINK-A敲低的細(xì)胞相比,糖酵解途徑在對(duì)照細(xì)胞中顯著富集(圖5A)。鑒于之前一項(xiàng)研究觀察到MCM3通過直接與HIF-1α相互作用負(fù)調(diào)控HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性,研究者試圖確定LINK-A是否激活HIF-1α以促進(jìn)腫瘤糖酵解。首先,研究者在常氧條件下,通過在LINK-A沉默的KYSE450細(xì)胞和LINK-A過表達(dá)的KYSE410細(xì)胞中進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn),確定LINK-A是否影響MCM3和HIF-1α的相互作用。結(jié)果表明,沉默LINK-A顯著增加MCM3與HIF-1α的相互作用,而過表達(dá)LINK-A則抑制MCM3與HIF-1α的相互作用(圖5B)。此外,研究者通過GST pull-down純化了MCM3和HIF-1α蛋白,然后在含有LINK-A的有義或反義鏈的緩沖液中進(jìn)行了體外coIP實(shí)驗(yàn)。在體外,LINK-A有義鏈而非反義鏈的存在抑制了MCM3和HIF-1α之間的相互作用(圖5C)。沉默LINK-A顯著抑制了缺氧反應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性,而過表達(dá)LINK-A增強(qiáng)了低氧反應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性(圖5D,E)。此外,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,在常氧和低氧條件下,LINK-A顯著促進(jìn)了HIF-1α靶基因的表達(dá),包括SLC2A1、PDK1、HK2、LDHA和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(圖5F,G)。值得注意的是,與常氧條件相比,在低氧條件下,LINK-A和HIF-1α靶基因的表達(dá)顯著上調(diào)(圖5F,G),進(jìn)一步證實(shí)了LINK-A和HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性之間的功能相關(guān)性。

 

 

圖5 LINK-A通過將HIF-1α從MCM3中分離來誘導(dǎo)HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活

 

       鑒于HIF-1α在癌癥代謝重編程中的重要作用,研究者進(jìn)行了Seahorse實(shí)驗(yàn)來確定LINK-A對(duì)腫瘤糖酵解的影響。敲低LINK-A顯著降低了細(xì)胞外酸化率(ECAR),但適度增加了氧消耗率(OCR)(圖5H,I)。同樣,LINK-A過表達(dá)增加了ECAR,但降低了OCR(圖5J,K)。進(jìn)一步研究HIF-1α是否介導(dǎo)LINK-A在食管鱗癌化療耐藥中的作用。細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果表明,HIF-1α抑制劑lificiguat(YC-1)和Digoxin處理顯著抑制了KYSE410和KYSE150細(xì)胞中LINK-A的致癌作用(圖5L,M)。綜上所述,這些結(jié)果表明,LINK-A通過消除MCM3介導(dǎo)的HIF-1α轉(zhuǎn)錄抑制來激活HIF-1α,進(jìn)而促進(jìn)糖酵解和化療耐藥。Seahorse檢測(cè)的結(jié)果顯示,F(xiàn)TO敲低后糖酵解活性顯著降低,隨后在LINK-A過表達(dá)后觀察到這種降低的逆轉(zhuǎn)(圖5N,O)。與這一發(fā)現(xiàn)一致,在FTO沉默細(xì)胞中過表達(dá)LINK-A恢復(fù)了增殖減少和化療耐藥性降低的表型(圖5P)。

6. 靶向LINK-A可使食管鱗癌對(duì)細(xì)胞毒性化療增敏

       為了確定靶向LINK-A是否為食管鱗癌有前景的治療策略,研究者建立了3個(gè)PDX模型。腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的LINK-A沉默顯著增加了ESCC pdx對(duì)DDP的敏感性(圖6A-F)。最后,研究者在圖1A所示的相同基線樣本中測(cè)定了LINK-A的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,與化療敏感樣本相比,化療耐藥樣本中LINK-A的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖6G)。進(jìn)一步的相關(guān)性分析顯示,在這些樣本中,LINK-A的表達(dá)與FTO的表達(dá)呈正相關(guān)(圖6H),進(jìn)一步證實(shí)了在ESCC化療耐藥過程中FTO對(duì)LINK-A的調(diào)控作用。綜上所述,研究者的研究結(jié)果證實(shí)了LINK-A是食管鱗癌化療耐藥的罪魁禍?zhǔn)祝沂玖薒INK-A介導(dǎo)食管鱗癌化療耐藥的潛在機(jī)制以及LINK-A在食管鱗癌化療耐藥中的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)。

 

 

圖6 靶向LINK-A使食管鱗癌對(duì)細(xì)胞毒性化療增敏

 

結(jié)論

       該研究揭示了食管鱗癌細(xì)胞中LINK-A的m6A去甲基化的細(xì)節(jié)。m6A去甲基化酶FTO介導(dǎo)了LINK-A的穩(wěn)定并支持其致癌作用。LINK-A與MCM3之間的直接相互作用不僅增加了CDK1介導(dǎo)的MCM3 Ser112的磷酸化,從而促進(jìn)MCM2-7復(fù)合體的組裝和染色質(zhì)負(fù)載,以及隨后的細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖,而且還從MCM3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制中釋放HIF-1α,從而促進(jìn)腫瘤代謝重編程和化療耐藥。綜上所述,該研究結(jié)果提示FTO/LINK-A/MCM3/HIF-1α軸在食管鱗癌的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用,這一發(fā)現(xiàn)為靶向LINK-A在食管鱗癌患者,尤其是LINK-A高表達(dá)患者中的治療提供了潛在的策略。

機(jī)制圖

 

 

 

實(shí)驗(yàn)方法

慢病毒的產(chǎn)生和感染,細(xì)胞活力測(cè)定,活細(xì)胞成像,細(xì)胞周期分析,蛋白質(zhì)印跡,RT-qPCR,m6斑點(diǎn)印跡測(cè)定,RNA pull-down,RIP,mRNA穩(wěn)定性測(cè)定,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),F(xiàn)ISH,IF染色,海馬檢測(cè),RNA-seq和數(shù)據(jù)分析,小鼠實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)

Nan Y, Liu S, Luo Q, Wu X, Zhao P, Chang W, Zhang R, Li Y, Liu Z. m6A demethylase FTO stabilizes LINK-A to exert oncogenic roles via MCM3-mediated cell-cycle progression and HIF-1α activation. Cell Rep. 2023 Oct 18;42(10):113273. doi: 10.1016/j.celrep.2023.113273.