骨髓祖細胞中NEK2的高表達抑制多發(fā)性骨髓瘤患者的T細胞免疫

       多發(fā)性骨髓瘤（MM）的生長是由免疫耐受骨髓微環(huán)境支持的。在這里，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境細胞中有絲分裂基因A（NIMA）相關(guān)激酶2（NEK2）中Never的缺失與MM生長抑制有關(guān)。NEK2的缺失導(dǎo)致腫瘤相關(guān)的巨噬細胞（TAMs）和抑制性T細胞的減少。髓系祖細胞中NEK2的表達在MM條件培養(yǎng)基刺激下促進功能性TAMs的產(chǎn)生。在臨床上，MM細胞中NEK2的高表達與CD8⁺ T效應(yīng)記憶細胞的增加有關(guān)，而NEK2的低表達與IFN-γ基因標(biāo)記和激活的T細胞反應(yīng)有關(guān)。抑制NEK2可上調(diào)MM細胞和髓細胞中PD-L1的表達。在小鼠模型中，NEK2抑制劑INH154與PD-L1抑制劑聯(lián)合使用可有效消除MM細胞并延長生存期。作者的研究結(jié)果提供了強有力的證據(jù)，證明NEK2抑制可以克服腫瘤免疫逃逸，并支持其進一步的臨床開發(fā)。本文于2023.10發(fā)表于《Cell Reports Medicine》，IF:14.3;Q1。

技術(shù)路線

研究機制圖

主要實驗結(jié)果

1、敲除NEK2可提高Eμ-myc小鼠的存活率并誘導(dǎo)T細胞活化

       NEK2在B細胞譜系中的過表達影響B(tài)細胞的發(fā)育。為了確定NEK2缺乏是否會抑制B細胞惡性腫瘤，作者生成了NEK2^-/-小鼠。接下來，作者將NEK2^-/-小鼠與Eμ-myc轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，Eμ-myc轉(zhuǎn)基因小鼠是一種成熟的Myc驅(qū)動的B細胞惡性嬰兒臨床前模型。Eμ-myc/Nek2^+/+和Eμ-myc/Nek2^+/-小鼠的存活率相似（圖1A）。然而，Eμ-myc/NEK2^+/-小鼠的存活時間顯著延長（圖1A），這表明NEK2的兩個等位基因的缺失延遲了B細胞淋巴瘤的進展。為了研究這些小鼠B細胞腫瘤發(fā)展的早期階段，作者在小鼠6-8周齡時采集了血液、骨髓和脾臟樣本。全血細胞計數(shù)分析顯示，與Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠相比，Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠的循環(huán)延遲淋巴細胞數(shù)量減少，血小板增加（圖1B）。脾臟和胸腺的重量也有所下降（圖1C）。BM和脾臟B細胞亞群的流量測定進一步發(fā)現(xiàn)，與Nek2^+/+小鼠相比，Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠的pre-B細胞和pro-B細胞增加，但成熟B細胞減少，而Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠的pre-B細胞和pro-B細胞減少，但成熟B細胞的損失不太明顯（圖1D）。因此，NEK2的缺失限制了Myc誘導(dǎo)的淋巴瘤發(fā)生。

       為了比較Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠與Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠的轉(zhuǎn)錄組特征，作者收集了癌前B細胞并進行了RNA測序（圖1E）。有趣的是，免疫相關(guān)通路顯著上調(diào)（圖1F），強烈提示缺乏NEK2與免疫激活有關(guān)。Cxcl9在抗腫瘤免疫中起關(guān)鍵作用，依賴于IFN-γ的產(chǎn)生，折疊變化最大（log2FC = 10.5）。一些抑制性免疫受體也上調(diào)，包括Cd274（編碼PD-L1）。為了驗證PD-L1的上調(diào)是否由于IFN-γ的激活，作者分析了小鼠B細胞中IFN-γ信號的下游靶點。與Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠相比，Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠中JAK/STAT1/IRF1信號顯著激活（圖1G和1H）。最后，為了確定荷瘤和非荷瘤小鼠Nek2^+/+和Nek2^-/-的T細胞激活狀態(tài)，作者進行了流式細胞術(shù)。與無腫瘤小鼠相比，Eμ-myc/Nek2^+/+小鼠的CD8⁺原始T細胞（T_N）受到抑制，但Eμ-myc/Nek2^-/-小鼠未觀察到這種損失（圖1I）。另一方面，CD8⁺T_EM顯示相反的情況（圖1I）。而PD1在T細胞上的表達無明顯變化。這些數(shù)據(jù)表明，在NEK2敲除的Eμ-myc小鼠中，T細胞反應(yīng)較少被驅(qū)動為效應(yīng)記憶表型，并且存在針對Myc誘導(dǎo)的B細胞惡性腫瘤的改善的T細胞免疫反應(yīng)。

圖1 敲除NEK2可提高Em-myc小鼠的存活率并誘導(dǎo)T細胞活化

2、NEK2缺失可減少腫瘤相關(guān)巨噬細胞和Tregs

       為了確定腫瘤微環(huán)境細胞中NEK2的缺乏如何促進腫瘤抑制和免疫調(diào)節(jié)，作者測試了NEK2^-/-小鼠中5TGM1 MM細胞的生長情況，并將其與NEK2^+/+窩鼠進行了比較（圖2A）。在Nek2^-/-小鼠中接種5TGM1 MM細胞可降低血清IgG2b水平，延長存活時間（圖2B和2C）。采用單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術(shù)研究BM細胞的細胞多樣性和轉(zhuǎn)錄組。使用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量控制，作者共分析了30284個BM細胞。將細胞投射到二維均勻流形近似和投影（UMAP）圖上，作者發(fā)現(xiàn)了17個不同的細胞簇（圖2D）。5TGM1 MM細胞通過高表達Sdc1（編碼CD138）被鑒定，并且只出現(xiàn)在5TGM1注射小鼠中。通過小鼠血清IgG2b水平測量，scRNA-seq顯示5TGM1/Nek2^-/-組（40%）與5TGM1/Nek2^+/+組（60%）相比，BM中MM細胞的百分比較低（圖2D）。在5TGM1 MM細胞注射小鼠中，正常漿細胞和pro-B細胞簇顯著減少，表明MM存在正常B細胞發(fā)育缺陷。這與最近的一篇報道一致，MM患者顯示正常漿細胞百分比降低。骨髓細胞是骨髓中最豐富的免疫細胞。與Nek2^+/+小鼠相比，荷瘤Nek2^+/+小鼠的巨噬細胞簇增加了3.6倍。

       一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，除了MM細胞和pro-B細胞外，NEK2在骨髓細胞和單細胞簇中表達最豐富（圖2E）。為了鑒定巨噬細胞集群中5TGM1/Nek2^+/+和5TGM1/Nek2^-/-組之間的差異表達基因，共鑒定出56個上調(diào)基因和43個下調(diào)基因（圖2F）。KEGG通路分析顯示，5TGM1/Nek2^-/-巨噬細胞中的鐵凋亡、破骨細胞分化和細胞周期減少（圖2G）。作者觀察到，與5TGM1/Nek2^+/+小鼠相比，5TGM1/Nek2^-/-小鼠的微計算機斷層掃描（μCT）顯示骨病變減少（圖2H），TRAP染色顯示5TGM1/Nek2^-/-小鼠的脛骨破骨細胞數(shù)量減少（圖2I）。5TGM1/Nek2^-/-巨噬細胞在抗原進程和呈遞、Fc γ R介導(dǎo)的吞噬、NOD樣受體信號通路和趨化因子信號通路中表現(xiàn)出陽性富集（圖2J）。為了進一步分析各組間巨噬細胞的表型差異，根據(jù)高可變基因的表達，共將740個巨噬細胞投影到UMAP圖上，并鑒定出四個巨噬細胞亞群（圖2K）。M-1亞群（Cirbp、Nfil3、Mt1、Apoe）、M-2亞群（CD36、Bcl2a1b）、M-3亞群（S100a9、S100a8、Lcn2）主要出現(xiàn)在荷瘤組，而這些基因在5TGM1/Nek2^-/-組中被抑制，其特征是被免疫抑制（Apoe、S100a9、S100a8）、巨噬細胞失活（Lcn2）、抗凋亡（Bcl2a1b）相關(guān)基因所控制（圖1K）。以抗原呈遞（Cd74）、巨噬細胞活化（Adgre4、Adgre5）和化療趨向性（Ccr2、Csf1r、Cx3cr1）相關(guān)基因為特征的M-0（Cd74、Ace、Adgre4）亞群在所有組中保持不變（圖2K）。NK/T細胞群比較（共627個細胞）顯示T-1（CD4, Foxp3, Ctla4）亞群顯著增加，其特征是與衰竭相關(guān)的基因（Foxp3, Ctla4）和T細胞激活標(biāo)志物（CD27, Gzmk, Gzma）的缺失（圖2L），表明T調(diào)節(jié)細胞（Tregs）在5TGM1/Nek2^+/+組中增加。作者得出結(jié)論，抑制NEK2可以減少TAMs和Tregs的積累。

圖2 NEK2的缺失會降低腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)和Tregs

3、NEK2缺乏降低了TAMs和MDSCs的免疫抑制活性

       為了證實作者的scRNA-seq發(fā)現(xiàn)，通過流式細胞術(shù)定量了小鼠BM和脾臟的免疫細胞群（圖3A、3B、S3A和S3B）。與5TGM1/Nek2^+/+小鼠相比，作者觀察到5TGM1/Nek2^-/-小鼠BM和脾臟中注射5TGM1 MM細胞的異常漿細胞（aPCs, CD19 ^- CD138⁺）受到抑制（圖3A）。與5TGM1/Nek2^+/+小鼠相比，5TGM1/Nek2^-/-小鼠脾臟中Ly6C^hi巨噬細胞（CD11b⁺ CD11c ^- F4/80⁺ Ly6C^hi）、MoMDSCs（CD11b⁺ CD11c ^- F4/80 ^- Ly6C^hiLy6G ^-）和G-MDSCs（CD11b⁺ CD11c ^- F4/80 ^- Ly6C^intLy6G⁺）減少（圖3A）。然而，在骨髓中沒有觀察到這些發(fā)現(xiàn)，因為原始小鼠骨髓可能含有大量的正常骨髓細胞，這些細胞在表型上與MDSCs無法區(qū)分。對于T細胞群，雖然在總T細胞中沒有觀察到明顯的變化，但與5TGM1/Nek2^-/-小鼠相比，5TGM1/Nek2^+/+小鼠的BM中CD4/CD8細胞比例增加（圖3B）。正如預(yù)期的那樣，與5TGM1/Nek2^-/-小鼠相比，CD4和CD8 T細胞在5TGM1/Nek2^+/+中PD-1的表達均增加，這表明T細胞具有更強的抑制性（圖3B）。與非5TGM1注射組相比，荷瘤組IFN-γ⁺或顆粒酶B⁺ CD8 T細胞的百分比均無顯著增加，但Nek2^+/+和Nek2^-/-之間的差異很小或沒有（圖3B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，微環(huán)境細胞中缺乏NEK2傾向于抑制功能性TAMs和MDSCs的產(chǎn)生，并減少抑制性T細胞群。

       鑒于TAMs和MDSCs可以通過細胞因子從原始BM細胞誘導(dǎo)，作者首先在體外測試了NEK2對細胞因子誘導(dǎo)的TAMs和MDSCs生成的影響（圖3C）。5TGM1條件培養(yǎng)基（CM）提高了Nek2^+/+小鼠來源的巨噬細胞的細胞存活率，而Nek2^-/-的巨噬細胞存活率較低（圖3D）。已知NEK2調(diào)節(jié)細胞有絲分裂。作者在巨噬細胞的細胞周期中觀察到類似的結(jié)果;即5TGM1 CM處理的Nek2^+/+巨噬細胞與5TGM1 CM處理的Nek2^-/-巨噬細胞相比，具有更高的S和G2/M群（圖3E）。與未處理的巨噬細胞相比，5TGM1 CM促進了CD206的表達，而NEK2缺乏則降低了CD206的表達（圖3F），表明NEK2促進了TAMs的分化。此外，與Nek2^+/+小鼠誘導(dǎo)的TAMs相比，由Nek2^-/-小鼠誘導(dǎo)的TAMs促進了T細胞增殖和IFN-γ的產(chǎn)生（圖3G）。作者假設(shè)NEK2在響應(yīng)腫瘤分泌因子時影響TAMs的激活。5TGM1 MM細胞與漿細胞差異表達基因的scRNA-seq分析顯示Mif和Hmgb1在MM細胞中高表達（圖3H）。為了研究NEK2是否能促進宏觀噬菌體對MIF-PI3K-AKT30和HMGB1-STAT3信號的反應(yīng)，作者進行了western blot，結(jié)果顯示，與未刺激的相關(guān)巨噬細胞相比，NEK2 ^+/+ TAMs中p110α、p110γ、PI3K III類、p-AKT（S473）和p-STAT3 （Y705）水平升高，而這些水平在NEK2^-/-TAMs中被阻斷（圖3I）。Nek2^+/+和Nek2^-/-小鼠的MDSCs中也觀察到類似的結(jié)果（圖3J - 3L）。這些發(fā)現(xiàn)表明NEK2增強了TAMs和MDSCs的免疫抑制功能。

圖3 NEK2缺乏降低了TAMs和MDSCs的免疫抑制活性

4、NEK2高表達的MM患者表現(xiàn)出T細胞反應(yīng)受損

       作者研究了來自堪薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)（UAMS）檔案（UAMS- MM）的324個MGUS、303個SMM、1049個NDMM和1066個RRMM的BM衍生的CD138選擇漿細胞中NEK2基因的表達模式。與SMM和MGUS相比，NDMM中的NEK2 mRNA水平升高（圖4A），RRMM中的NEK2 mRNA水平相對于NDMM進一步升高（圖4A）。此外，與GEP70評分定義的低風(fēng)險（LR）MM相比，HR MM中的NEK2更高（圖4A）。根據(jù)基因表達模式，MM可分為7個分子亞型，其中NEK2在增殖（PR）亞型中表達最高，在超二倍體（HY）亞型中表達最低（圖4B）。在多發(fā)性骨髓瘤研究基金會（MMRF）的CoMMpass數(shù)據(jù)集中，包括606個NDMM樣本，證實了不同MM亞型的NEK2差異（圖4B）。對UAMS-MM和MMRF CoMMpass數(shù)據(jù)的Kaplan-Meier分析顯示，NEK2高表達的MM患者總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）較差（圖4C）。

       為了確定NEK2表達水平與免疫效應(yīng)細胞的相關(guān)性，作者使用免疫細胞面板進行了細胞計數(shù)（CyTOF）。根據(jù)NEK2在CD138選擇的漿細胞中的表達情況，將BM抽吸樣品分為NEK2^high組（n = 6）和NEK2^low組（n = 6）。為了分析免疫細胞亞型和免疫檢查點表達，作者對門控CD45⁺細胞進行了FlowSOM分析。由于T細胞是MM患者中最豐富的細胞群，并且已報道與患者預(yù)后相關(guān)，作者進一步分析了T細胞亞群和T細胞激活狀態(tài)。結(jié)果顯示，大多數(shù)T細胞處于終末活化狀態(tài)。其中，T_EM和T_EMRA細胞在CD8⁺ T細胞中最多，而T_EM和T_CM （T central memory）細胞在CD4⁺ T細胞中最多;CD4⁺和CD8⁺ T細胞中T_N的表達最少（圖4D）。NEK2^low組CD8⁺ T_EM細胞減少（圖4D）。此外，PD1⁺ CD8⁺ T細胞的百分比與NEK2表達顯著相關(guān)（圖4E和4F）。在NEK2高表達的MM樣品中觀察到CD8⁺ T細胞增殖能力降低（圖4G）。此外，CD8⁺ T細胞產(chǎn)生IFNγ與NEK2表達水平呈負相關(guān)，但未觀察到TNFα和IL-6的變化（圖4H）。這些結(jié)果表明NEK2是MM的預(yù)后標(biāo)志物，腫瘤細胞中高NEK2與T細胞功能受損有關(guān)。

圖4 NEK2高表達的MM患者表現(xiàn)出T細胞反應(yīng)受損

5、NEK2抑制MM患者的IFN-γ/PD-L1信號通路

       作者觀察到IFN-γ基因特征與CIN基因特征之間呈負相關(guān)（圖5A）。與作者的動物研究一致（圖1G），作者還觀察到，在UAMS-MM和MMRF CoMMpass數(shù)據(jù)集中，IFN-γ誘導(dǎo)基因CD274與NDMM樣品中的NEK2表達呈負相關(guān)（圖5B）。CD274在HY亞型中表達最高，在PR亞型中表達最低（圖5C），這與其他研究一致，基于流式細胞檢測數(shù)據(jù)顯示PD-L1在超二倍體患者中增加。為了確定NEK2和CD274聯(lián)合表達是否能更好地預(yù)測患者預(yù)后，作者將患者分為四組，NEK2^highCD274^high、NEK2^highCD274^low、NEK2^lowCD274^high和NEK2^lowCD274^low。Kaplan-Meier分析顯示NEK2^lowCD274^high患者的OS和PFS最佳（圖5D）。為了驗證NEK2和PD-L1表達在蛋白水平上的相關(guān)性，作者對50例NDMM活檢樣本進行了NEK2和PD-L1的免疫組織化學(xué)（IHC）分析。繪制PD L1陽性與NEK2陽性細胞的百分比顯示，NEK2和PD- L1的蛋白水平呈負相關(guān)（圖5E）。這些結(jié)果表明，IFN-γ/PD-L1信號軸在高NEK2的MM細胞中受到壓迫。

圖5 NEK2抑制MM患者的IFN-g/PD-L1信號通路

6、NEK2抑制與抗PD - L1單抗聯(lián)合治療可提供治療益處

       基于NEK2抑制損害TAMs和MDSCs功能，同時上調(diào)MM細胞中PD-L1表達的發(fā)現(xiàn)，作者假設(shè)NEK2抑制劑INH154與抗PD-L1單抗聯(lián)合使用將具有額外的治療益處。為了驗證這一假設(shè)，作者對BM-MNCs進行了體外處理（圖6A）。INH154處理顯著降低了CD138⁺ MM細胞的百分比（圖6B），提示INH154選擇性靶向MM細胞可能是由于其相對較高的增殖能力。PD-L1單抗對MM細胞沒有明顯的殺傷作用，這可能是由于抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用有限。PD-L1單抗可有效阻斷INH154處理后MM細胞和髓細胞中PD-L1表達的增加（圖6C和6D）。此外，INH154和聯(lián)合治療后，總T細胞增加，而CD8⁺和CD4⁺ T細胞占總T細胞的百分比無明顯變化（圖6E）。此外，在INH154和聯(lián)合治療后，PD1⁺ CD8⁺和CD4⁺ T細胞的百分比均下降（圖6F）。這些數(shù)據(jù)表明，NEK2阻斷選擇性地抑制原發(fā)性骨髓瘤樣本中MM細胞的生長并減少PD1⁺ T細胞，并且通過阻斷MM和單核細胞上的PD-L1表達（NEK2抑制后PD-L1表達增加），與PD-L1單抗聯(lián)合使用可提供更好的治療效果。

圖6 NEK2抑制可提高抗pd - l1單克隆抗體(mAb)抗MM的效力

       為了測試聯(lián)合治療對well-es-建立的臨床前V_k*MYC MM小鼠模型的療效，在V_k12653 MM細胞注射前1天單獨或聯(lián)合給藥INH154和PD-L1 mAb，隨后每周兩次給藥，持續(xù)5周（圖7A）。單獨治療時，IHN154和PD-L1單抗均可降低V_k12653 MM細胞注射后第35天的血清γ-球蛋白水平，聯(lián)合治療時觀察到進一步降低（圖7B）。此外，Kaplan-Meier生存分析顯示，聯(lián)合治療組的生存期顯著延長（圖7C）。INH154和PD-L1單抗處理小鼠的脾臟重量均較低，聯(lián)合治療進一步降低（圖7D）。流式細胞術(shù)分析BM和脾臟中CD138⁺ B220 ^- MM細胞百分比及其PD-L1表達水平顯示，聯(lián)合治療組MM細胞百分比顯著降低（圖7E、7F）。此外，在INH154處理后，MM細胞上PD-L1的表達略有增加，而在PD-L1單抗處理后，PD-L1的表達幾乎完全被阻斷（圖7E、7F）。這些數(shù)據(jù)表明抑制劑INH154中的NEK2通過提高PD-L1水平和增強CD8⁺ T細胞活性，顯著增強抗PD-L1單抗的抗腫瘤功效。

圖7 聯(lián)合NEK2抑制與抗pd - l1單抗治療在MM小鼠模型中提供治療效果

結(jié)論

       研究強烈表明，在環(huán)境中阻斷NEK2可以通過增強抗腫瘤免疫來延緩MM腫瘤的進展。具體來說，髓系祖細胞中NEK2的缺乏減少了功能性TAMs和MDSCs的產(chǎn)生，從而增強了T細胞的抗腫瘤功能。通過評估NEK2在MM免疫中的臨床意義發(fā)現(xiàn)較高的NEK2表達與CD8⁺ T_EM細胞頻率增加有關(guān)，而較低水平的NEK2富集與PD-L1表達升高相關(guān)的IFN-γ基因特征。NEK2抑制劑INH154通過提高PD-L1水平和增強CD8⁺ T細胞活性，顯著增強抗PD-L1單抗的抗腫瘤療效。

實驗方法

體內(nèi)治療；小鼠血清蛋白電泳；流式細胞術(shù)；Bulk RNA序列；單細胞RNA序列（scRNA-seq）；生物信息學(xué)分析；微計算機斷層掃描（μCT）；骨組織形態(tài)計量學(xué)；體外TAMs和MDSCs生成；T細胞與TAMs或MDSCs共培養(yǎng)的功能測定；細胞活力和細胞周期；Western Blot；人骨髓瘤細胞的分離純化；基因表達譜分析；實時定量PCT；人T細胞功能測定；免疫組化；細胞計數(shù)術(shù)（CyTOF）；原代BM-MNCs的體外處理。

參考文獻

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