TREM2巨噬細(xì)胞是乳腺癌肺轉(zhuǎn)移邊界的調(diào)節(jié)因子

       乳腺癌仍然是婦女癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。乳腺癌的死亡幾乎都是腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的。肺部是乳腺癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位之一，診斷后中位生存時(shí)間不到兩年。為解開(kāi)乳腺癌轉(zhuǎn)移的秘密，作者對(duì)免疫微環(huán)境的綜合分析揭示了轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)過(guò)程中免疫細(xì)胞分子狀態(tài)的關(guān)鍵改變，并闡明了乳腺癌轉(zhuǎn)移不同空間，不同免疫亞群的景觀。本文于2023年9月發(fā)布在《Cancer Discovery》,IF=28.2。

技術(shù)路線(xiàn)

主要研究結(jié)果

1、乳腺癌肺轉(zhuǎn)移免疫微環(huán)境詳細(xì)圖譜

       最近的研究利用scRNA-seq鑒定了原發(fā)性乳腺腫瘤的免疫微環(huán)境。然而，大多數(shù)研究忽視了對(duì)轉(zhuǎn)移灶免疫微環(huán)境的綜合分析。為了確定轉(zhuǎn)移微環(huán)境以及轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的異質(zhì)性和可塑性的原理，作者開(kāi)始在時(shí)間和空間上解剖轉(zhuǎn)移相關(guān)免疫細(xì)胞在轉(zhuǎn)移進(jìn)展過(guò)程中的功能亞群。為此，作者利用小鼠自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型，將tdTomato-EO771乳腺癌細(xì)胞原位注射到乳腺(圖1A)。為了模擬臨床環(huán)境，手術(shù)切除原發(fā)腫瘤，隨后發(fā)生自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移。作者分離并分析了不同階段和空間區(qū)域的免疫細(xì)胞。作者收集了原發(fā)乳腺腫瘤切除前小鼠轉(zhuǎn)移前生態(tài)位(pre-MET)和明顯轉(zhuǎn)移灶小鼠的細(xì)胞。然后，在原發(fā)腫瘤切除后，每周使用CT監(jiān)測(cè)小鼠的轉(zhuǎn)移情況，并在首次CT檢測(cè)到轉(zhuǎn)移后不久收集樣本。使用tdTomato標(biāo)記和顯微鏡檢查，作者能夠區(qū)分含有轉(zhuǎn)移灶的肺組織和遠(yuǎn)端正常組織。還從未發(fā)生轉(zhuǎn)移的小鼠身上收集細(xì)胞，歸類(lèi)為無(wú)復(fù)發(fā)。為了解剖和比較不同空間區(qū)域的免疫微環(huán)境，作者利用光激活GFP (PA-GFP)小鼠作為乳腺腫瘤和自發(fā)性轉(zhuǎn)移的受體，從而通過(guò)應(yīng)用NICHE-seq技術(shù)進(jìn)行空間分析。最后，作者從對(duì)照PA-GFP小鼠的肺中分離出免疫細(xì)胞，并將來(lái)自EO771-tdTomato原發(fā)腫瘤的免疫細(xì)胞納入圖譜。對(duì)27只小鼠的63份樣本進(jìn)行scRNA測(cè)序。作者鑒定了9個(gè)T細(xì)胞和NK細(xì)胞群(圖1B和C)，包括na?ve CD4和CD8細(xì)胞(CD4 Lel1和CD8 Dapl1)，活化CD4 (CD4 S100a4)和CD8 (CD8 Gzmk和CD8 Gzma)細(xì)胞，功能失調(diào)的CD8 (CD8 Lag3)和Treg (Foxp3)細(xì)胞。NKs分為NK Ncr1和NK Xcl1兩個(gè)種群。骨髓細(xì)胞包括樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(圖1D)。樹(shù)突狀細(xì)胞分為cDC1 (Naaa)、cDC2 (CD209a)、遷移DC (migDC、Ccr7)和類(lèi)漿細(xì)胞(Siglech)。單核細(xì)胞被分離成經(jīng)典單核細(xì)胞(Mon Ace)和表達(dá)纖維連接蛋白(Mon Fn1)或血栓反應(yīng)蛋白(Mon Thbs1)的單核細(xì)胞亞群。巨噬細(xì)胞分為肺泡巨噬細(xì)胞(Mac Cd9)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Mac Cd81和Mac is20)和巨噬細(xì)胞群，作者之前鑒定為巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞(Mregs)，它們獨(dú)特地表達(dá)Trem2、Gpnmb和Cd63等基因。通過(guò)S100a8表達(dá)鑒定的中性粒細(xì)胞，通過(guò)Ptgs2(編碼前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化物合成酶，或COX2)、Ifit3、Lcn2和Camp的表達(dá)將其分為亞群。

圖1. 乳腺癌肺轉(zhuǎn)移免疫微環(huán)境詳細(xì)圖譜

2、肺轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)性腫瘤表現(xiàn)出不同的免疫景觀

       作者使用NICHE-Seq標(biāo)記自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型中的特異性轉(zhuǎn)移駐留細(xì)胞(圖2A)，比較來(lái)自原發(fā)乳腺腫瘤和肺轉(zhuǎn)移核心的免疫細(xì)胞，而不是平均整個(gè)肺組織。為了確保肺組織的光激活不會(huì)引起捕獲細(xì)胞的偏差，作者對(duì)對(duì)照小鼠肺組織進(jìn)行了光激活，并對(duì)GFP陽(yáng)性或陰性的CD31CD45+細(xì)胞進(jìn)行了分類(lèi)。作者在細(xì)胞類(lèi)型和亞群水平上比較了轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)腫瘤(PT)的整體免疫組成，發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移核心的免疫景觀高度不同(圖2B和C)?；诩?xì)胞類(lèi)型和亞群頻率的主成分分析顯示，這兩個(gè)位置之間存在明顯的差異(圖2D)，表明原發(fā)腫瘤的免疫景觀與轉(zhuǎn)移瘤的免疫景觀截然不同。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)檢查主要免疫譜系的差異，作者發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤相比，NK細(xì)胞增加，而B(niǎo)細(xì)胞和DC細(xì)胞在轉(zhuǎn)移中減少(圖2E)。雖然原發(fā)腫瘤與Tregs水平升高有關(guān)，但轉(zhuǎn)移時(shí)活化的CD8 Gzmk細(xì)胞、CD8 Gzma、功能失調(diào)的CD8 Lag3 T細(xì)胞水平升高，活化/na?ve T細(xì)胞比例總體增加(圖2F和G)，表明一組不同的信號(hào)塑造了轉(zhuǎn)移性微環(huán)境。轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)瘤的主要單核細(xì)胞群都是Mon Thbs1，然而，轉(zhuǎn)移瘤增加了Mon Fn1的比例，減少了抗原呈遞Mon MHC-II(圖2H和I)。此外，雖然轉(zhuǎn)移瘤被Mac is20和Mregs浸潤(rùn)，但原發(fā)瘤中的巨噬細(xì)胞主要是Mac Cd81群(圖2J)，表達(dá)補(bǔ)體系統(tǒng)基因(C1qa/b/c, Fcna)， MHC-II (H2-Ab1, Cd74, Cd81)，Ccl8已被證明在乳腺癌腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tam)中富集，并支持癌細(xì)胞傳播(圖2K和L)。因此，轉(zhuǎn)移性免疫微環(huán)境由不同的細(xì)胞亞群、途徑和檢查點(diǎn)組成，在設(shè)計(jì)臨床前藥物開(kāi)發(fā)研究時(shí)應(yīng)仔細(xì)考慮這些差異。

圖2. 肺轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)性腫瘤表現(xiàn)出不同的免疫景觀

3、轉(zhuǎn)移前肺微環(huán)境的特征是單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化

       為了研究轉(zhuǎn)移發(fā)生前肺部免疫環(huán)境的變化，作者比較了在原發(fā)腫瘤切除前注射EO771-tdTomato細(xì)胞系第20天正常肺和荷瘤小鼠肺的免疫環(huán)境(圖3)。作者發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠在這個(gè)轉(zhuǎn)移前階段就已經(jīng)有了肺免疫環(huán)境的顯著改變(圖3B)。具體來(lái)說(shuō)，巨噬細(xì)胞、B、NK和T細(xì)胞減少，而PreMET生態(tài)位中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞增加(圖3C)。有趣的是，在Pre-MET微環(huán)境中，常駐(肺泡)巨噬細(xì)胞的比例急劇減少(圖3C)。這些發(fā)現(xiàn)與先前報(bào)道的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在肺轉(zhuǎn)移前轉(zhuǎn)移階段的擴(kuò)增一致。為了確保作者的發(fā)現(xiàn)不具有模型特異性或小鼠品系特異性，作者在另外一種三陰性乳腺癌小鼠模型中進(jìn)行了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)。作者向WT (Balb/c)小鼠原位注射4T1-tdTomato細(xì)胞系，3周后手術(shù)切除原發(fā)腫瘤，每周進(jìn)行CT監(jiān)測(cè)，隨訪(fǎng)自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)。值得注意的是，在注射4T1乳腺癌模型的小鼠的Pre-MET肺中，中性粒細(xì)胞的增加和T細(xì)胞的減少也很明顯，這表明這種機(jī)制在肺轉(zhuǎn)移生態(tài)位的形成中通常很重要。NLR在臨床上被用作幾種癌癥適應(yīng)癥的預(yù)后生物標(biāo)志物，高血液NLR與不良預(yù)后相關(guān)。作者的研究結(jié)果表明，這些變化是在轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的早期引起的，并且在轉(zhuǎn)移前階段已經(jīng)起作用。除了淋巴細(xì)胞的整體減少外，作者還觀察到活化的CD8 Gzmk和細(xì)胞毒性CD8 Gzma T細(xì)胞，表達(dá)顆粒酶(Gzma, Gzmb, Gzmk)，Ccl4, Ccl5和Klrc1, Klrc2的減少(圖3D和E)。這些發(fā)現(xiàn)與先前報(bào)道的轉(zhuǎn)移前肺中T細(xì)胞功能障礙增加的研究一致。這些早期的免疫改變，可能是由原發(fā)腫瘤的系統(tǒng)信號(hào)引起的，暗示了免疫抑制在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成中，可能使到達(dá)生態(tài)位的播散性癌細(xì)胞免疫逃避。Pre-MET肺中最豐富的免疫細(xì)胞是單核細(xì)胞，與對(duì)照組相比，單核細(xì)胞的增加也最高(圖3B和C)。這種明顯的變化與單核細(xì)胞組成的轉(zhuǎn)變相吻合，其中Pre-MET中經(jīng)典單核細(xì)胞(Mon Ace)被Mon Fn1群體所取代(圖3F)。monfn1細(xì)胞群的特點(diǎn)是炎癥特征，包括趨化因子受體Ccr2和Ccr1的表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞募集、免疫抑制和腫瘤促進(jìn)因子，如凝集素(Lgals3/9)和NLRP3炎性小體抑制劑Tmem176b(圖3G)。此外，與健康肺部的經(jīng)典單核細(xì)胞Mon Ace相比，Mon Fn1細(xì)胞富含細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)因子，如Mmp8、Vcan和纖維連接蛋白(Fn1)，以及細(xì)胞間粘附和脂質(zhì)代謝過(guò)程(如低密度脂蛋白受體Ldlr)。這些分子譜可能表明，ECM重塑和代謝改變先于轉(zhuǎn)移發(fā)生(圖3H)。與單核細(xì)胞類(lèi)似，在轉(zhuǎn)移前的肺生態(tài)位中，中性粒細(xì)胞組成從高前列腺素表達(dá)的成熟細(xì)胞(Neut Ptgs2)轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺准?xì)胞(Neut Ifit3和Neut Lcn2)(圖3I)。炎癥中性粒細(xì)胞上調(diào)IFN-I信號(hào)、中性粒細(xì)胞次級(jí)顆粒因子(Ngp)和中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NET)形成所需的Padi4的表達(dá)(圖3J)?；蚣患治?GSEA)顯示，與正常肺中發(fā)現(xiàn)的Neut Ptgs2相比，Pre-MET富集的Neut Lcn2在趨化途徑、IL-1β產(chǎn)生和IFN-I中含量較高(圖3K)。這些發(fā)現(xiàn)表明，中性粒細(xì)胞在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位介導(dǎo)炎癥微環(huán)境，促進(jìn)轉(zhuǎn)移進(jìn)展。為了評(píng)估不同免疫群體之間的相互作用，作者接下來(lái)使用CellChat算法分析了Pre-MET和對(duì)照肺免疫區(qū)間的細(xì)胞間相互作用。作者發(fā)現(xiàn)，除了單核細(xì)胞-中性粒細(xì)胞相互作用和單核細(xì)胞自分泌相互作用外，Pre-Met肺內(nèi)相互作用強(qiáng)度總體降低(圖3L)。具體來(lái)說(shuō)，在轉(zhuǎn)移前肺中上調(diào)的相互作用包括Ccl6(單核細(xì)胞)-Ccr2(中性粒細(xì)胞)信號(hào)軸(圖3L)。因此，作者假設(shè)這些分泌因子可能參與單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞向轉(zhuǎn)移前肺的募集。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者進(jìn)行了transwell試驗(yàn)。收集對(duì)照組和轉(zhuǎn)移前小鼠的肺組織，將其加工成單細(xì)胞懸液，并將肺勻漿的非細(xì)胞部分用作骨髓源性細(xì)胞的化學(xué)吸引介質(zhì)(圖3M)。流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓細(xì)胞的遷移情況。作者發(fā)現(xiàn)，與正常肺的分泌因子相比，來(lái)自Pre-met肺的分泌因子顯著增強(qiáng)了單核細(xì)胞(CD45+ Ly6C+)和粒細(xì)胞(CD45+ Ly6G+)的遷移(圖3N)。此外，在Pre-MET肺勻漿中，CCL6的功能性抑制顯著減少了單核細(xì)胞的募集(圖3N)，這表明該信號(hào)軸在免疫轉(zhuǎn)移生態(tài)位的形成中具有功能性作用。總之，這些數(shù)據(jù)表明，在原發(fā)性乳腺癌腫瘤存在時(shí)，肺免疫環(huán)境經(jīng)歷了巨大的重塑，包括單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞特異性炎癥群的涌入，而肺泡巨噬細(xì)胞、活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞群則減少。這些系統(tǒng)性的變化可能有助于形成一個(gè)適宜的微環(huán)境，有利于播散性癌細(xì)胞的播種和擴(kuò)張。

圖3. 轉(zhuǎn)移前肺微環(huán)境的特征是單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化

4、不同的免疫群體定義了轉(zhuǎn)移的空間生態(tài)位

       為了更好地了解轉(zhuǎn)移生態(tài)位的組成，作者接下來(lái)對(duì)免疫mTME生態(tài)位本身進(jìn)行了表征，并分析了來(lái)自肺轉(zhuǎn)移病變的細(xì)胞與同一肺遠(yuǎn)端正常組織的比較，并與對(duì)照小鼠進(jìn)行了比較(圖4A)。與作者在Pre-met肺中發(fā)現(xiàn)的免疫重塑類(lèi)似，遠(yuǎn)端正常和轉(zhuǎn)移組織均表現(xiàn)出單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的富集，相反，與對(duì)照組相比，B細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和nk的豐度較低，這代表了Pre-met表型的持久性(圖4B)。有趣的是，從未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移(無(wú)復(fù)發(fā))的小鼠肺中的免疫微環(huán)境與對(duì)照小鼠相似(圖4B)，進(jìn)一步表明免疫mTME的重塑對(duì)于轉(zhuǎn)移進(jìn)展至關(guān)重要。對(duì)轉(zhuǎn)移瘤和遠(yuǎn)端正常組織主要免疫譜系差異的分析顯示，巨噬細(xì)胞的富集是最顯著的變化(圖4B)。為了更好地表征肺轉(zhuǎn)移空間生態(tài)位之間的差異，作者比較了免疫亞群頻率，并對(duì)不同空間區(qū)域的細(xì)胞組成進(jìn)行了PCA，確定了三種組織原型(圖4C)。一種由來(lái)自非腫瘤/轉(zhuǎn)移小鼠的組織組成，即對(duì)照樣本和無(wú)復(fù)發(fā)部位，富含淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞(藍(lán)色)。第二組由Pre-met和遠(yuǎn)端正常組織組成，富含中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，特別是Mon Fn1(橙色)。第三種原型由轉(zhuǎn)移組織組成，富含表達(dá)IFN-I的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和抑制性Mregs(紅色)。為了進(jìn)一步鑒定分離轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端正常組織的細(xì)胞模塊，作者將不同樣本的組織組成進(jìn)行了關(guān)聯(lián)(圖4D)。共識(shí)層次聚類(lèi)揭示了四個(gè)單元模塊。具體來(lái)說(shuō)，作者確定了一個(gè)抑制性細(xì)胞模塊，由功能失調(diào)的CD8 Lag3、Tregs、PMN-MDSCs、Mregs和表達(dá)Mon Thbs1和Mac is20亞群的IFN-I組成。該細(xì)胞模塊僅在轉(zhuǎn)移中發(fā)現(xiàn)(圖4E)。單核細(xì)胞是遠(yuǎn)端正常組織和轉(zhuǎn)移組織中最豐富的細(xì)胞類(lèi)型(如PreMET)，與對(duì)照組相比增加最多(圖4B)。這種浸潤(rùn)由特定的單核細(xì)胞亞群組成。遠(yuǎn)端正常組織和轉(zhuǎn)移組織都相對(duì)缺乏經(jīng)典的循環(huán)單核細(xì)胞表型(Mon Ace)，取而代之的是Mon Fn1群(Pre-met肺的主要成分)。轉(zhuǎn)移組織也被Mon Thbs1群體高度浸潤(rùn)，遠(yuǎn)端正常浸潤(rùn)程度較小(圖4F)。這種基因表達(dá)譜可能表明，轉(zhuǎn)移特異性單核細(xì)胞支持初始轉(zhuǎn)移灶中的炎癥和血管形成過(guò)程。轉(zhuǎn)移中的巨噬細(xì)胞有兩個(gè)特定的轉(zhuǎn)移相關(guān)巨噬細(xì)胞群，Mac is20和Mreg(圖4G)。作者通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)從對(duì)照組、Pre-MET或轉(zhuǎn)移性肺中分離巨噬細(xì)胞(CD45+ F4/80+)，并將其與T細(xì)胞(從na?ve小鼠中分離)共培養(yǎng)。對(duì)T細(xì)胞增殖能力的分析顯示，與從對(duì)照組或Pre-MET組織分離的巨噬細(xì)胞相比，從轉(zhuǎn)移性肺組織分離的巨噬細(xì)胞能減弱T細(xì)胞的增殖(圖4J)。總之，與對(duì)照肺組織相比，轉(zhuǎn)移性免疫微環(huán)境的戲劇性重編程表明轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)影響整個(gè)器官。此外，這一過(guò)程的特點(diǎn)是特定區(qū)域的改變，以及在轉(zhuǎn)移性肺組織中促進(jìn)免疫抑制的微生態(tài)位的發(fā)展。

圖4. 肺轉(zhuǎn)移的進(jìn)展與非常規(guī)免疫細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)有關(guān)

5、轉(zhuǎn)移性侵襲邊緣以抑制TREM2巨噬細(xì)胞為特征

       在幾種癌癥類(lèi)型和小鼠模型中，腫瘤浸潤(rùn)邊緣具有不同于腫瘤核心的特定細(xì)胞群。因此，作者接下來(lái)要問(wèn)的是，在轉(zhuǎn)移性病變中是否也存在類(lèi)似的差異。作者的自發(fā)轉(zhuǎn)移模型使作者不僅能夠標(biāo)記位于轉(zhuǎn)移灶核心的細(xì)胞，還能夠標(biāo)記位于浸潤(rùn)邊緣的細(xì)胞- tdtomato標(biāo)記的轉(zhuǎn)移灶周?chē)膮^(qū)域(圖5A和B)。作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的核心和浸潤(rùn)邊緣是不同的生態(tài)位，顯示不同的免疫組成(圖5C和D)。與遠(yuǎn)端正常組織相比，在轉(zhuǎn)移組織中富集的Tregs和PMN-MDSCs實(shí)際上幾乎只存在于轉(zhuǎn)移核心，而不存在于浸潤(rùn)邊緣，這表明在這些不同的轉(zhuǎn)移壁位中存在獨(dú)特的信號(hào)傳導(dǎo)(圖5E)。在單核細(xì)胞內(nèi)，monthbs1群體高度集中在轉(zhuǎn)移核心，而monfn1在轉(zhuǎn)移灶浸潤(rùn)邊緣占主導(dǎo)地位(圖5F)。巨噬細(xì)胞亞群在轉(zhuǎn)移核心和邊緣之間也存在差異，Mac Isg20群體主導(dǎo)核心，而Mregs群體主導(dǎo)邊緣(圖5g)。Mac is20的特征是中性粒細(xì)胞趨化劑Cxcl1/Cxcl2/Cxcl3的表達(dá)，之前與轉(zhuǎn)移形成有關(guān)，c型凝集素結(jié)構(gòu)域家族成員Clec4d和Clec4n, Il1b和IFN-I信號(hào)基因的表達(dá)。作者的分析顯示，Mreg巨噬細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)有力的抑制性免疫檢查點(diǎn)，包括Trem2、Gpnmb和Cd63(圖5H)。與葡萄糖分解代謝導(dǎo)向的Mac is20相比，Mregs偏向于脂質(zhì)分解代謝，并且在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中表達(dá)組織蛋白酶B、D、K和S的水平升高(圖5I)。具體而言，轉(zhuǎn)移核心的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞Ccl2、Ccl7和Ccl12的表達(dá)增加，與Ccr2表達(dá)增加相一致。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的Ccl6/9/-Ccr1信號(hào)軸在轉(zhuǎn)移核中也上調(diào)。該軸也可以直接作用于表達(dá)Ccr1受體的癌細(xì)胞，促進(jìn)它們?cè)诜尾康臏?。為了更好地闡明轉(zhuǎn)移核心和浸潤(rùn)邊緣組成的差異，作者進(jìn)行了細(xì)胞模塊分析，其中作者將轉(zhuǎn)移核心和浸潤(rùn)邊緣細(xì)胞的細(xì)胞群頻率聯(lián)系起來(lái)，揭示了四種細(xì)胞模塊。模塊1由浸潤(rùn)邊緣富集cDC1、Mon Fn1、Mac Cd9和Mreg組成。模塊2由核心富集的Treg、cDC2、Mon Thbs1和Mac is20組成。IFN-I信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)TME中的不同細(xì)胞有一系列影響，可以增加抗腫瘤免疫，也可以在信號(hào)傳導(dǎo)持續(xù)的情況下導(dǎo)致免疫功能障礙。值得注意的是，核心富集的細(xì)胞模塊都具有IFN-I信號(hào)基因的上調(diào)，這表明這是轉(zhuǎn)移核心的一個(gè)主要特征。為了確定肺轉(zhuǎn)移壁龕中空間上不同的細(xì)胞群，作者進(jìn)行了一項(xiàng)分析，比較了轉(zhuǎn)移性組織與遠(yuǎn)端正常組織的富集，以及核心與浸潤(rùn)邊緣的富集。有趣的是，除了Mregs外，細(xì)胞群的動(dòng)態(tài)是相關(guān)的。換句話(huà)說(shuō)，除了Mregs外，所有轉(zhuǎn)移富集的群體也在轉(zhuǎn)移核心中富集。這一發(fā)現(xiàn)表明，Mreg巨噬細(xì)胞群位于轉(zhuǎn)移灶周?chē)?，而非轉(zhuǎn)移灶核心，是轉(zhuǎn)移灶肺組織的標(biāo)志(圖5J)。有趣的是，最近也觀察到Mreg人群對(duì)免疫治療不良反應(yīng)具有高度預(yù)測(cè)性。接下來(lái)，作者研究了轉(zhuǎn)移性肺組織中巨噬細(xì)胞群體的特定空間域是否與它們調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活的不同功能有關(guān)。因此，作者結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析蛋白表達(dá)和scRNA-seq，使用指數(shù)排序來(lái)定義一個(gè)有效的小組，用于從轉(zhuǎn)移性肺組織中分離Mreg和功能分析。作者發(fā)現(xiàn)從轉(zhuǎn)移性肺組織中分離的Mregs顯示特異性標(biāo)志物的共表達(dá)，包括CD9、PDPN、TREM2、GPNMB、SPP1和IL7R。相比之下，Mac Isg20細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出這種共表達(dá)模式(圖5K)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Mreg巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)移中的空間分布，作者使用GPNMB作為Mreg群體的標(biāo)記物，對(duì)EO771乳腺癌肺轉(zhuǎn)移進(jìn)行了免疫熒光成像(圖5M)。事實(shí)上，GPNMB+細(xì)胞主要在轉(zhuǎn)移灶浸潤(rùn)邊緣檢測(cè)到。進(jìn)一步驗(yàn)證作者的發(fā)現(xiàn)，在距離轉(zhuǎn)移邊界一定距離的間隔內(nèi)定量GPNMB+細(xì)胞的百分比，證實(shí)Mregs在轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)邊緣高度富集(圖5N)。這些結(jié)果與作者之前的研究一致，表明脂肪組織或疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(DAM)中的TREM2+巨噬細(xì)胞存在于病理組織周?chē)蛊涿馐苓M(jìn)一步的免疫損傷。CD9+ TREM2+巨噬細(xì)胞表達(dá)GPNMB、SPP1、FABP5和CD63，在小鼠和人肺纖維化中被報(bào)道，在疤痕邊緣富集。綜上所述，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)骨髓間室是區(qū)分轉(zhuǎn)移核心和侵襲前沿的免疫環(huán)境的主要特征，表明骨髓間室在轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)邊緣的免疫抑制和ECM重塑中起作用，從而掩蓋了轉(zhuǎn)移灶抗腫瘤免疫的作用，促進(jìn)了轉(zhuǎn)移擴(kuò)張。最后，作者想知道作者在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型浸潤(rùn)邊緣富集TREM2+ Mregs的發(fā)現(xiàn)是否也適用于人類(lèi)肺轉(zhuǎn)移。為此，作者對(duì)包括乳腺癌、黑色素瘤和軟組織肉瘤在內(nèi)的多種癌癥轉(zhuǎn)移患者的肺組織切片進(jìn)行了免疫熒光成像。Mreg染色分析表明，與作者在小鼠肺轉(zhuǎn)移中的發(fā)現(xiàn)類(lèi)似，TREM2+細(xì)胞在人肺轉(zhuǎn)移的侵襲邊緣積聚(圖6A)，這表明巨噬細(xì)胞亞群的特定生態(tài)位空間分布在人免疫轉(zhuǎn)移生態(tài)位的形成中也起著關(guān)鍵作用。

圖5. 轉(zhuǎn)移性浸潤(rùn)邊緣由抑制性TREM2巨噬細(xì)胞填充

圖6. Mregs積聚在人肺轉(zhuǎn)移灶的浸潤(rùn)邊緣

結(jié)論

       總的來(lái)說(shuō)，本研究的結(jié)果提供了對(duì)轉(zhuǎn)移性肺免疫微環(huán)境的更深入了解，并強(qiáng)調(diào)了巨噬細(xì)胞在促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展中的重要性。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)開(kāi)發(fā)針對(duì)轉(zhuǎn)移生態(tài)位中特定巨噬細(xì)胞群體的新治療策略具有啟示意義。作者的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了更好地了解器官特異性免疫變化的重要性，這有助于開(kāi)發(fā)更準(zhǔn)確、更有效的免疫療法來(lái)抑制轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)。

實(shí)驗(yàn)方法

原位腫瘤移植、single-cell RNA-seq、SPID-seq、遷移實(shí)驗(yàn)、共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、免疫熒光、生信分析

參考文獻(xiàn)

Yofe I, Shami T, Cohen N, Landsberger T, Sheban F, Stoler-Barak L, Yalin A, Phan TS, Li B, Monteran L, Scharff Y, Giladi A, Elbaz M, David E, Gurevich-Shapiro A, Gur C, Shulman Z, Erez N, Amit I. Spatial and temporal mapping of breast cancer lung metastases identify TREM2 macrophages as regulators of the metastatic boundary. Cancer Discov. 2023 Sep 27. doi: 10.1158/2159-8290.CD-23-0299. Epub ahead of print. PMID: 37756565