外泌體circ_0001785延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生

       內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是早期動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因。盡管細(xì)胞外囊泡在穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的作用已得到證實(shí)，但循環(huán)外泌體對斑塊形成的影響尚不清楚。在這里，我們基于外泌體可以作用于細(xì)胞間通訊的功能，探討了外泌體對動(dòng)脈粥樣硬化的影響。體外共培養(yǎng)結(jié)果顯示，冠狀動(dòng)脈疾病患者血漿來源外泌體數(shù)量增加，內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和凋亡加重。過表達(dá)circ_0001785可通過miR513a-5p/TGFBR3的ceRNA網(wǎng)絡(luò)途徑減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷。circ_0001785在冠狀動(dòng)脈疾病患者循環(huán)外周血中的表達(dá)量減少，而在人和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中表達(dá)量增加。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circ_0001785可減輕小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷和斑塊內(nèi)新血管形成，增強(qiáng)左室舒張功能，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。我們的研究結(jié)果證明了一種新的動(dòng)脈粥樣硬化生物標(biāo)志物—外泌體來源的circ_0001785，它可以通過miR-513a-5p/TGFBR3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)機(jī)制減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，為動(dòng)脈粥樣硬化提供了一種基于外泌體的干預(yù)策略。本文于2023年10月發(fā)表于“Journal of Nanobiotechnology”（IF=10.2）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）血漿外泌體對冠狀動(dòng)脈疾病患者內(nèi)皮細(xì)胞的影響

       首先，我們分離冠狀動(dòng)脈疾病患者和非冠狀動(dòng)脈疾病患者的外泌體。我們通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察到直徑為30-150nm的球形顆粒(圖1A, 1B)，這與外泌體的大小和形態(tài)一致。對于外泌體的標(biāo)記蛋白CD9和CD81，我們通過納米流式細(xì)胞術(shù)(nFCM)對它們進(jìn)行了檢測(圖1C, 1D)。此外，我們通過納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術(shù)確定了外泌體的大小(圖1E,1 F)。有趣的是，在不同疾病的外泌體樣本的電子顯微鏡下，我們發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈疾病患者釋放的外泌體比非冠狀動(dòng)脈疾病患者多(圖1A，1B)。為了探索這些外泌體對內(nèi)皮細(xì)胞的影響，我們用PKH67標(biāo)記患有和未患有冠狀動(dòng)脈疾病的患者的外泌體，并將其培養(yǎng)到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中。連續(xù)標(biāo)記24小時(shí)后，我們用共聚焦顯微鏡觀察到外泌體已被HUVECs有效內(nèi)化。但在有和沒有冠狀動(dòng)脈疾病的患者中，內(nèi)皮細(xì)胞被外泌體內(nèi)化的程度沒有明顯變化(圖1G,1I)。我們隨后測試了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞活力(圖1J, 1M)。結(jié)果表明，冠狀動(dòng)脈疾病患者的血漿外泌體削弱了內(nèi)皮細(xì)胞的活力和增殖能力。

2）circ_0001785在冠狀動(dòng)脈疾病患者中的表達(dá)

       為了確定circ_0001785的結(jié)構(gòu)特征，我們首先檢測了它對RNase R消化的耐受性。結(jié)果表明，circ_0001785對RNase R具有顯著的耐受性，進(jìn)一步證明了circ_0001785的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖2A)。為了驗(yàn)證circ_0001785的反向剪接位點(diǎn)，我們進(jìn)行了Sanger測序。從測序結(jié)果可以看出，circRNA含有ELP3基因外顯子背對背剪接位點(diǎn)(圖2B)。此外，我們發(fā)現(xiàn)cDNA中的circ_0001785可以在HUVECs的cDNA中檢測到，但不能在HUVECs的gDNA中檢測到(圖2C)。我們隨后研究了外泌體circ_0001785對冠狀動(dòng)脈疾病患者動(dòng)脈粥樣硬化的影響。我們首先確定了circ_0001785的細(xì)胞起源。我們發(fā)現(xiàn)circ_0001785在單核細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定，且其表達(dá)量明顯高于其他兩組。因此，我們確定circ_0001785主要來源于單核細(xì)胞(即主要來源于白細(xì)胞)(圖2E)。接下來，我們提取冠狀動(dòng)脈疾病患者的白細(xì)胞，通過qRT-PCR檢測circ_0001785的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circ_0001785在冠狀動(dòng)脈疾病患者白細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于健康對照患者(圖2F)。當(dāng)我們檢查下肢動(dòng)脈粥樣硬化斑塊患者的斑塊組織時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)斑塊組織中的circ_0001785明顯多于斑塊旁邊的其他組織(圖2G)。因此，我們認(rèn)為circ_0001785可能在斑塊形成或內(nèi)皮細(xì)胞損傷期間通過外泌體轉(zhuǎn)移到損傷部位。為了進(jìn)一步確定circ_0001785與臨床冠狀動(dòng)脈疾病患者之間的關(guān)系，我們根據(jù)冠狀動(dòng)脈狹窄程度將20例患者分為兩組(III級50%-75%，IV級75%-100%)，結(jié)果顯示嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈狹窄患者的circ_0001785水平明顯低于中度冠狀動(dòng)脈狹窄患者(圖2H)。

3）內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的功能科學(xué)驗(yàn)證

       首先，我們研究了外泌體與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后circ_0001785的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circ_0001785在冠狀動(dòng)脈疾病病患者組中的表達(dá)明顯降低(圖3A)。因此，我們認(rèn)為外泌體來源的circ_0001785可能在冠狀動(dòng)脈疾病中發(fā)揮重要作用。為了更好地模擬人類冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生的環(huán)境，本研究建立了一種新的動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。我們用ox-LDL聯(lián)合LPS共刺激內(nèi)皮細(xì)胞，通過內(nèi)皮細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)模型建立成功，并再次分析模型的生物學(xué)功能。為了更好地模擬人類冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)展環(huán)境，本研究建立了一種新的AS伴炎癥浸潤模型。模型采用ox-LDL聯(lián)合LPS共同刺激ECs。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與2000 ng/ml LPS + 100 ng/ml ox-LDL相比，1000 ng/ml LPS + 200 ng/ml oxLDL對ECs的毒性更大，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。通過對ECs損傷模型的功能驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)在ECs凋亡實(shí)驗(yàn)中，1000 ng/ml LPS + 100 ng/ml ox-LDL和1000 ng/ml LPS + 200 ng/ml ox-LDL的凋亡程度更強(qiáng)且顯著，而2000 ng/ml LPS + 100 ng/ml ox-LDL的凋亡程度不那么顯著(圖3D-3F)。ECs的傷口愈合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)ox-LDL和LPS濃度達(dá)到500 ng/ml LPS + 100 ng/ml ox-LDL時(shí)，ECs的遷移能力開始增強(qiáng)(圖3E, 3F)。當(dāng)ox-LDL和LPS濃度超過1000 ng/ml LPS + 100 ng/ml ox-LDL時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖顯著下降(圖3C-3F)。本研究為模擬人類AS提供了較優(yōu)質(zhì)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。

4）circ_0001785通過miR-513a-5p/TGFBR3的ceRNA網(wǎng)絡(luò)軸發(fā)揮作用

       為了確定circ_0001785的下游靶基因，我們首先進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。在之前的研究中，我們確定了circ_0001785/miR-513a-5p/TGFBR3的靶向通路。為了驗(yàn)證預(yù)測的靶標(biāo)，基于circ_0001785和miR-513a-5p之間可能的結(jié)合位點(diǎn)，我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-513a-5p顯著降低wt型circ_0001785熒光素酶活性，而不降低mut型circ_0001785熒光素酶活性(圖4A, 4B)。上述結(jié)果也表明circ_0001785可以通過堿基互補(bǔ)直接與miR-513a-5p結(jié)合。同樣，我們也驗(yàn)證了miR-513a-5p與TGFBR3的結(jié)合(圖4C, 4D)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-513a-5p和TGFBR3的表達(dá)，我們分別從冠狀動(dòng)脈疾病患者和健康對照中提取RNA，對miR-513a-5p和TGFBR3進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示冠狀動(dòng)脈疾病患者血液中miR-513a-5p表達(dá)升高，TGFBR3表達(dá)顯著降低(圖4E, 4F)。我們檢查了下肢動(dòng)脈粥樣硬化斑塊患者的斑塊組織，發(fā)現(xiàn)斑塊組織中miR-513a-5p的含量明顯低于斑塊旁的其他組織，而TGFBR3的含量則高于斑塊旁的其他組織(圖4G, 4H)。

5）circ_0001785通過miR-513a-5p/ TGFBR3促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制凋亡和遷移

       我們進(jìn)一步探討circ_0001785是否通過miR-513a-5p/TGFBR3通路影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和凋亡。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-513a-5p在一定程度上減弱了circ_0001785過表達(dá)引起的增殖促進(jìn)作用(圖5A, 5B)，以及對細(xì)胞凋亡的抑制作用(圖5C)和內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用(圖5D)。我們還通過qRT-PCR檢測了TGFBR3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)circ_0001785的內(nèi)皮細(xì)胞中，TGFBR3的表達(dá)水平顯著升高，而miR-513a-5p模擬物的加入能夠拮抗這種表達(dá)的增加，導(dǎo)致TGFBR3的表達(dá)降低 (圖5E)。上述實(shí)驗(yàn)提示circ_0001785可以通過抑制miR-513a-5p間接調(diào)節(jié)TGFBR3的表達(dá)，從而發(fā)揮其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和遷移的作用。

6）小鼠動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮損傷模型的建立

       我們建立了具有動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和炎癥浸潤的小鼠模型。具體分組為：對照組、AMI、ApoE^?/?+ AMI、ApoE^?/?+ AMI + PBS、ApoE^?/?+ AMI + LV-oe circ_0001785、ApoE^?/?+ AMI + LV-oe circNC。其中，ApoE^?/?小鼠在左前降支結(jié)扎前給予高脂肪喂養(yǎng)10周(圖6A)。與對照組和AMI組相比，ApoE^?/?+ AMI小鼠更容易發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞脫離和炎癥浸潤，斑塊擴(kuò)大(圖6B、6D、6E)。同時(shí)，模型組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化增加，膠原含量增加，纖維帽變薄(圖6C、6F)。我們從臨床取出下肢動(dòng)脈粥樣硬化患者的斑塊組織，進(jìn)行HE和Masson染色，我們發(fā)現(xiàn)下肢動(dòng)脈粥樣硬化患者斑塊組織中炎癥浸潤和膠原纖維均明顯增加，與小鼠模型中動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的病變特征一致(圖6G, 6H)。

7）過表達(dá)circ_0001785導(dǎo)致小鼠內(nèi)皮損傷減少，左心室舒張功能增強(qiáng)

       我們通過超聲心動(dòng)圖研究circ_0001785過表達(dá)對AMI后心臟功能的影響。與PBS組或circ_NC組相比，過表達(dá)circ_0001785治療后EF和FS均有改善，提示過表達(dá)circ_0001785可減緩心肌梗死后左心室功能障礙(圖7B, 7E-7F)。通過Masson染色，我們觀察到注射circ_0001785慢病毒的小鼠梗死面積顯著減少(圖7C-7G)。此外，我們在ApoE^?/?+ AMI + PBS組小鼠斑塊中發(fā)現(xiàn)新血管 (圖7D)。我們進(jìn)一步驗(yàn)證circ_0001785在老鼠模型中所扮演的角色，我們發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血液中circ_0001785的表達(dá)明顯降低(圖7E)。

結(jié)論

       我們證明circ_0001785通過抑制miR513a-5p上調(diào)TGFBR3來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷，從而減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，這提高了我們對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成內(nèi)源性機(jī)制的理解。

實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物模型、外泌體提取、外泌體追蹤、納米流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、傷口愈合試驗(yàn)、CCK-8、EdU實(shí)驗(yàn)、HE染色、Masson染色、免疫組化。

參考文獻(xiàn)

Tong X, Dang X, Liu D, Wang N, Li M, Han J, Zhao J, Wang Y, Huang M, Yang Y, Yang Y, Wang W, Kou Y, Kou J. Exosome-derived circ_0001785 delays atherogenesis through the ceRNA network mechanism of miR-513a-5p/TGFBR3. J Nanobiotechnology. 2023 Oct 4;21(1):362. doi: 10.1186/s12951-023-02076-x.