急性髓系白血病治療：依美司他誘導鐵死亡發(fā)生

簡介

       急性髓系白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）是一種罕見的侵襲血液及骨髓的腫瘤，是白血病家族中成年人最常見的類型之一，它進展快速，極具侵襲性。患者的5年總生存率不到45%，主要是由于化療或靶向治療后的疾病復發(fā)。端粒酶在大多數癌癥包括AML中高度表達和重新激活，因此它可作為一種治療靶點。伊美司他作為端粒酶抑制劑已被驗證在血液系統(tǒng)髓系惡性腫瘤中具有臨床療效，但機制尚不明確。本研究中作者證明了伊美司他促進含有多不飽和脂肪酸的磷脂的形成，導致脂質過氧化和氧化應激水平過高；伊美司他的療效在ROS清除后降低。作者計劃利用這些機制開發(fā)一種優(yōu)化的治療策略，使用氧化應激誘導化療來提高患者樣本對伊美司他的敏感性，從而在AML中實現(xiàn)疾病控制。該研究于2023年10月30日發(fā)表在《Nature Cancer》，IF：22.7

技術路線

主要研究結果

1. 建立AML患者來源的人源性組織異種移植（PDX）模型

       成功移植到NSGS中的AML患者樣本隨機選擇30例，根據患者年齡、性別、ELN2017預后風險、WHO疾病分類等臨床參數進行表征（圖1a-c），發(fā)現(xiàn)17個樣本來自女性AML患者（圖1b），OncoPrint圖表明NPM1、DNMT3A、ARID1B和FLT3等基因中經常檢測到致癌突變（圖1c）?？傊?，作者成功建立了AML患者來源的PDX模型。

圖1： AML患者樣本的綜合分析

2. AML PDX中伊美司他的II期臨床前試驗

       為了驗證伊美司他在AML中的臨床前療效，將30個AML患者樣本分別移植到12個NSGS受體（n=360個PDX）中。出現(xiàn)AML負荷后，將PDX隨機分為伊美司他治療組和載體（PBS）對照治療組，治療至少持續(xù)30天。與對照組相比，伊美司他治療的中位生存期顯著延長（圖2a），外周血供體嵌合、骨髓細胞和供體嵌合、AML患者衍生細胞數量以及脾臟供體嵌合顯著減少（圖2b-g）。作者還評估了與白血病起始活性相關的AML表面標記物的變化（圖2h）。脾臟AML細胞群中富集的CD34⁺CD38^-白血病干細胞在伊美司他治療后顯著降低（圖2i）。

       接下來作者評估了PDX中伊美司他治療的轉錄結果，與對照組相比，伊美司他治療的AML供體細胞顯著富集了功能注釋為干擾素信號、細胞周期、TP53轉錄調節(jié)和MAPK信號的基因（圖2j，k）；同時，AML供體細胞中TERT mRNA在治療后呈現(xiàn)下降趨勢（圖2l）），但端粒長度無明顯變化（圖2m，n）。

圖2： 伊美司他在AML PDX的隨機II期臨床前試驗中的療效

3. CRISPR/Cas9篩選識別伊美司他的關鍵效應物

       作者使用人類全基因組敲除文庫（Brunello文庫）進行陽性篩選以鑒定對伊美司他產生耐藥性的基因，聯(lián)合RIGER和STARS算法確定了七個功能基因：脂肪酸去飽和酶2（FADS2）、酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）、線粒體內膜轉位酶17A（TIMM17A）、晚期內體/溶酶體銜接子、MAPK和MTOR激活劑1-3（LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3）和肌球蛋白調節(jié)輕鏈相互作用蛋白（MYLIP）（圖3a）；它們在調節(jié)脂質代謝、鐵離子結合、線粒體基質和溶酶體生物發(fā)生和定位等功能上具有密切關系（圖3b）。作者隨后進行了競爭實驗，確定FADS2或ACSL4功能喪失會導致伊美司他治療的AML細胞具有競爭生長優(yōu)勢（圖3c-f）。當使用CD33（預測對細胞功能有中性影響）敲除或空載對照時，伊美司他治療后未觀察到競爭生長（圖3c-f）。上述結果表明ACSL4和FADS2是伊美司他在AML治療中的關鍵效應物。

圖3： 利用全基因組CRISPR/Cas9缺失鑒定伊美司他療效的關鍵介質

4. 伊美司他是鐵死亡的誘導劑

       多不飽和脂肪酸（PUFA）磷脂合成的關鍵酶受到ACSL4和FADS2的編碼調節(jié)。作者發(fā)現(xiàn)在NB4細胞中，伊美司他治療后PUFA磷脂顯著富集，FADS2缺失則減少了這種脂質的富集（圖4a）。這表明伊美司他以FADS2依賴性的方式誘導PUFA磷脂合成。

       ACSL4被認為是鐵死亡的關鍵調節(jié)因子。鐵死亡的標志之一是脂質過氧化，因此ACSL4與脂質過氧化密切相關。為了驗證伊美司他與脂質過氧化的關系，作者用C11-BODIPY（脂質過氧化熒光探針）處理AML細胞，圖5b可以看出伊美司他治療后熒光強度顯著增加，這表明伊美司他在體外誘導AML細胞發(fā)生脂質過氧化。接下來作者評估了活性氧（ROS）是否也受到伊美司他影響，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，伊美司他治療后ROS顯著增加，當加入活性氧清除劑Ferrostatin-1后，增加變少了，這表明伊美司他促進AML細胞中的ROS生成（圖5a）。在ACSL4或FADS2功能缺失的AML細胞中，脂質過氧化和ROS生成明顯降低，表明伊美司他誘導的脂質過氧化和ROS產生依賴于體外功能性FADS2和ACSL4（圖4b，c）。AML PDX模型中體內驗證了伊美司他誘導的脂質過氧化與ACSL4表達增加有關（圖5c）；liproxstatin處理不僅抑制伊美司他誘導的脂質過氧化和ROS生成（圖5d，e），而且降低了伊美司他的療效（圖5f）。

       以上數據表明伊美司他通過ACSL4和FADS2介導的PUFA代謝、過度脂質過氧化和氧化應激改變誘導細胞鐵死亡發(fā)生。

圖4： 伊美司他是鐵死亡的有效誘導劑

圖5： ROS清除降低伊美司他療效

5. 脂代謝先于伊美司他誘導的鐵死亡

       通過轉錄組學和功能遺傳學綜合研究伊美司他誘導鐵死亡的機制。作者在Brunello文庫和AML PDX RNA-seq數據集中取交集，確定了11個伊美司他靶點候選物（圖6a），其中兩種VIM（波形蛋白）和LMNA（核纖層蛋白A/C），是共調節(jié)模塊的一部分（圖6a），最近被鑒定為端粒G-四鏈體結合蛋白。VIM除了結合端粒G-四鏈體外，還是脂滴生物發(fā)生和穩(wěn)定性的結構成分。

       作者假設伊美司他誘導的PUFA磷脂合成、氧化應激和鐵死亡由脂噬引起。AML細胞中VIM高度表達（圖6b），VIM功能缺失導致細胞在伊美司他治療后具有競爭生長優(yōu)勢（圖6c）。利用C12-BODIPY（一種脂滴的熒光脂肪酸探針）和LAMP1（晚期內體標記物）評估脂噬，發(fā)現(xiàn)脂滴與內體的共定位顯著增加，表明脂噬增加（圖6d）。通過氯喹抑制脂噬后伊美司他誘導的細胞死亡也隨之減少（圖6e）。

       上述結果證明了AML中伊美司他的作用機制：通過調控端粒G-四鏈體結合蛋白干擾脂滴結構成分導致脂滴穩(wěn)態(tài)受損，發(fā)生脂噬，最終誘導鐵死亡發(fā)生。

圖6：轉錄組學與功能遺傳學的綜合分析

6. 氧化應激信號分辨持續(xù)應答

       作者接下來尋找伊美司他反應和耐藥的生物標志物。對585個在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中頻繁突變的基因的綜合組織進行基因組測序得到數據，觀察到信號傳導或細胞粘附/代謝相關基因的致癌突變更頻繁（圖7a）。突變型NRAS與伊美司他治療的反應增強有關，與AML PDX中野生型NRAS相比，突變型NRAS減少AML負荷，提高存活率（圖7b，c）。此外， AML患者樣本中獲得的RNA-seq數據進行基因集富集分析（GSEA），發(fā)現(xiàn)在持續(xù)應答伊美司他的樣本中，翻譯/病毒感染相關的基因呈陽性富集，細胞周期、抗病毒免疫、跨膜轉運和血紅素清除相關的基因呈陰性富集（圖7d）。Hallmark特征顯示，持續(xù)應答伊美司他與細胞凋亡、干擾素-α反應、DNA修復、TP53途徑、過氧化物酶體、脂肪酸代謝和ROS生成途徑有關（圖7e）。

       接下來，作者研究了端粒長度是否與伊美司他應答相關。通過端粒限制性片段（TRF）分析確定端粒長度，長度范圍在2.7-12 kb，30例AML患者樣本中有5例含有多個端粒長度不同的亞克隆（圖7f），表明基線端粒長度和伊美司他應答無相關性（圖7f）。

       上述結果表明伊美司他在大多AML PDX中有效。此外，對伊美司他的持續(xù)應答與基線端粒長度無關，與NRAS突變和氧化應激基因有關。

圖7：突變NRAS和氧化應激基因表達特征與對伊美司他的持續(xù)應答相關

7. 氧化應激誘導AML PDX對伊美司他敏感

       AML誘導緩解治療的標準方案是蒽環(huán)類藥物聯(lián)合標準劑量阿糖胞苷。為了探究該療法是否能使AML細胞對伊美司他治療敏感，作者用阿糖胞苷聯(lián)合阿霉素預處理AML細胞，隨后用伊美司他治療，發(fā)現(xiàn)標準誘導化療以劑量依賴性的方式顯著增加ROS水平和細胞死亡（圖8a，b）。

       NRAS野生型AML PDX模型在單劑量標準誘導化療后使用伊美司他導致體內ROS水平顯著增加（圖8c）。早期治療組之間的脂質過氧化沒有顯著差異（圖8c）；但在經過完整的誘導化療周期后使用伊美司他治療發(fā)現(xiàn)脂質過氧化和ROS水平顯著增加（圖8d）。

       隨后，作者在20例AML患者樣本來源的不同PDX（n=480）中依次給予標準誘導化療，再進行伊美司他治療（圖8e）。與對照治療、伊美司他單獨治療、單獨標準誘導化療（圖8f）相比，聯(lián)合治療組的AML負荷顯著降低（圖8g）。

       上述數據表明用標準誘導化療誘導氧化應激可使AML細胞對伊美司他誘導的脂質過氧化和鐵死亡更敏感，顯著改善治療效果（圖8h）。

圖8：氧化應激誘導和標準誘導化療使AML細胞對伊美司他敏感

結論

        通過開發(fā)和利用AML PDX資源庫和人類細胞系，結合基因組學、轉錄組學和脂質組學，作者證明伊美司他是鐵死亡的誘導劑，可減輕患者AML負荷并延緩化療后的復發(fā)。作者證明對AML患者采用序貫治療即先采用標準誘導化療隨后利用伊美司他鞏固療效，這一治療方式可顯著延遲或預防AML的復發(fā)。后續(xù)臨床試驗將重點關注伊美司他在預防AML復發(fā)或與靶向治療一起改善AML患者預后的作用。

實驗方法

小鼠模型，異種移植實驗，藥物治療研究，血液分析，流式細胞術，qPCR，細胞培養(yǎng)和體外細胞生長分析，蛋白質印跡，共聚焦顯微鏡，突變測序，RNA測序，脂質組學

參考文獻

Bruedigam C, Porter AH, Song A, et al. Imetelstat-mediated alterations in fatty acid metabolism to induce ferroptosis as a therapeutic strategy for acute myeloid leukemia [published online ahead of print, 2023 Oct 30]. Nat Cancer. 2023;10.1038/s43018-023-00653-5. doi:10.1038/s43018-023-00653-5.