包裹線粒體的融合脂質(zhì)體作為治療骨關(guān)節(jié)炎有前景的遞送系統(tǒng)
利用線粒體（MT）治療人類疾病已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試；然而，MT很大，因此很難有效傳遞。因此，建立了基于膜融合的轉(zhuǎn)移策略。設(shè)計(jì)并合成了融合線粒體膠囊（FMCs），其包含中性脂質(zhì)（PE）、陽離子脂質(zhì)（DOTAP）、芳香族脂質(zhì)（Liss Rhod PE）和三種類型的脂質(zhì)體（FMC0、FMC1和FMC2）。影響膜融合效率的DOTAP含量在不同的FMC制劑中有所不同。通過DLS、TEM和AFM分析這些FMC的特征，并分別通過FRET、mtDNA拷貝數(shù)和CLSM確認(rèn)FMC-MT和FMC軟骨細(xì)胞之間的封裝和融合效率。與裸MT相比，F(xiàn)MCs向軟骨細(xì)胞的輸送速度更快、效率更高。此外，融合是一種比內(nèi)吞作用更穩(wěn)定的遞送方式，這一點(diǎn)從減少了對線粒體自噬的誘導(dǎo)而得到了證明。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)MCs減少炎性細(xì)胞因子和MMP13的表達(dá)，增加細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)，促進(jìn)軟骨再生。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)MCs是一種非常有效和有前途的MT遞送策略，以促進(jìn)軟骨再生，并突出了它們作為MT轉(zhuǎn)移治療的新平臺(tái)的潛力。本研究于2023年10月發(fā)表在《Biomaterials》期刊上，IF=14.0。
主要技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1、FCs和FMCs的表征及MT包封評價(jià)
在這項(xiàng)研究中，作者從干細(xì)胞裂解后獲得的核/MT/細(xì)胞質(zhì)中分離出MT（裸（n）MT）。為了確認(rèn)分離線粒體的純度，采用Western blot方法鑒定每個(gè)部分中的標(biāo)記蛋白。核膜蛋白Lamin B1被鑒定為核分離標(biāo)記，細(xì)胞骨架蛋白α-微管蛋白被鑒定為細(xì)胞質(zhì)分離標(biāo)記，線粒體外膜蛋白TOMM20被鑒定為線粒體分離標(biāo)記。因此，可以確定在每個(gè)片段中都表達(dá)了相應(yīng)的標(biāo)記物，并以此驗(yàn)證線粒體分離良好。為了證實(shí)分離的MT的功能，作者測量了裂解物中ATP的量，以及細(xì)胞色素C氧化酶（CCO）的表達(dá)；兩者都隨著MT數(shù)量的增加而增加。這表明從干細(xì)胞分離的MT在細(xì)胞外的功能是正常的。
陽離子脂質(zhì)體被用作運(yùn)送核酸的載體，核酸是一種陰離子物質(zhì)，其中一個(gè)典型的例子是lipofectamine。受此啟發(fā)，作者假設(shè)陽離子脂質(zhì)體將有利于負(fù)離子線粒體的傳遞，并進(jìn)行了這項(xiàng)研究。為了穩(wěn)定地包封陰離子MT，作者制造了融合越來越多的陽離子脂質(zhì)DOTAP的促聚變膠囊（FC）。圖1A提供了該方法的簡要說明。脂質(zhì)體包括PE、Liss Rhod PE和DOTAP。作者改變陽離子脂質(zhì)DOTAP的比例為0、1和2。Liss Rhod PE發(fā)出紅色熒光，使作者能夠?qū)χ|(zhì)體進(jìn)行詳細(xì)成像。
首先，作者用CLSM從形態(tài)上證實(shí)了MTs被包裹在FCs中（圖1B）。用Mitotracker Green標(biāo)記的MT被包裹在脂質(zhì)體中，綠色熒光與羅丹明（脂質(zhì)體）的紅色熒光重疊。這些重疊的（黃色）信號表明許多MT被包裹在脂質(zhì)體中。此外，體素圖像顯示，脂質(zhì)體中的MT是穩(wěn)定的。這些結(jié)果表明，F(xiàn)C和FMC的形狀沒有差異，表明FMC包裹線粒體保持了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。
為了定量比較MT的包埋效率，進(jìn)行了FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）分析（圖1C）。MT用綠色Mitotracker標(biāo)記（λex=490/λem=516），脂質(zhì)體用Liss Rhod PE標(biāo)記（λex=560/λem=583）。利用488 nm激光激發(fā)并測量發(fā)射波長范圍為520~650 nm的曲線圖，計(jì)算了FRET效率。含DOTAP量最高的FMC2對MT的包封率最高，且隨DOTAP含量的增加而增加?？傮w而言，陽離子脂質(zhì)體FMC1和FMC2的包封率高于陰離子脂質(zhì)體FMC0。陽離子脂質(zhì)體與陰離子線粒體相互作用的條件更有利，其效率與DOTAP的量成正比。因此，基于DOTAP的陽離子脂質(zhì)體可以作為線粒體膠囊的假設(shè)得到了證實(shí)。
接下來，進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)，以確定MT與FC的最佳包封率。作者發(fā)現(xiàn)1：2的比例是最有效的。這一結(jié)果得到了異質(zhì)性分析的驗(yàn)證，結(jié)果表明，以此MT與脂質(zhì)體的比例制備的FMCs中，大鼠線粒體DNA在細(xì)胞中的表達(dá)最高。因此，在隨后的所有實(shí)驗(yàn)中，作者都使用了這個(gè)比率，并將得到的被包裹的線粒體膠囊稱為FMC2。
接下來，利用原子力顯微鏡（AFM）（圖1D）研究了不同DOTAP比率的FCs的物理性質(zhì)。FCs的直徑相似（600-700 nm），但高度不同：FC0測量130 nm，F(xiàn)C1測量50 nm，F(xiàn)C2測量18 nm。相應(yīng)的RQ值分別為49.85、17.31和7.56。這些結(jié)果證實(shí)了FCs的柔性與DOTAP的量成正比，而其剛性與DOTAP的量成反比。這些發(fā)現(xiàn)突出了DOTAP含量和靈活性對于優(yōu)化脂質(zhì)體MT包封率的重要性。綜上所述，這些結(jié)果表明FMC2是最佳制劑。
FCs和FMCs用透射電子顯微鏡（TEM）成像（圖1E）。在形態(tài)上，F(xiàn)Cs和FMCs的形態(tài)沒有差異，表明包裹線粒體的FMCs保持了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。
此外，作者通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測量脂質(zhì)體大小的變化，間接證實(shí)了這些MT被包裹到FCs中。不含MT的FCs（MT非囊化，僅脂質(zhì)體）小于含有線粒體（MT囊化）的FMCs（圖1F）。約25 ~ 80nm的大小變化表明脂質(zhì)體隨著MT的包封而變大。
接下來，作者研究了DOTAP的量如何影響MT包裹后脂質(zhì)體的Zeta電位（ZP）（圖1G）。MT本身具有約38 mV的負(fù)電荷；然而，脂質(zhì)體中帶正電荷的脂類攜帶+40 mV或更多的高電荷。當(dāng)帶正電的DOTAP的比例增大時(shí)，ZP增大。使用含有DOTAP的陽離子脂質(zhì)體（FC1和2）有利于包裹MT，因?yàn)樗汝庪x子脂質(zhì)體（FC0）更容易通過靜電作用與MT的陰離子膜結(jié)構(gòu)反應(yīng)。此外，與陰離子NMT或FMC0相比，陽離子FMC1和2有望與細(xì)胞膜更有利地相互作用。
圖1 FCs和FMCs的表征，以及FCs的NMT封裝
2、FMCs及其內(nèi)部線粒體的穩(wěn)定性與NMT的比較
接下來，作者研究了FCs和FMCs隨時(shí)間的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并與nMT進(jìn)行了比較（圖2）。將制備的FCs和FMCs分別在緩沖溶液中保存12周和5天，并用DLS測量包膜形成的保留程度（圖2A）。結(jié)果證實(shí)，無論DOTAP比率如何，F(xiàn)CS在長達(dá)12周的時(shí)間內(nèi)保持其原始大?。ㄗ髨D）。通過這些結(jié)果，作者強(qiáng)調(diào)，作者生產(chǎn)的融合蛋白膠囊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以長期儲(chǔ)存。然而，nMT的大小從第3天開始顯著增加（右圖）。作者確定，這種結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的現(xiàn)象可能是線粒體分解的開始，也可能是生理/生理功能障礙的跡象。換句話說，從第3天開始就確定了nMT的生存能力。因此，確定長期檢查FMC的穩(wěn)定性是沒有意義的，并對穩(wěn)定性進(jìn)行了長達(dá)5天的評估。結(jié)果表明，脂質(zhì)體在包裹MT后的第5天內(nèi)，其大小基本保持不變，說明脂質(zhì)體的穩(wěn)定性在5天內(nèi)沒有明顯變化，這是因?yàn)橹|(zhì)體的陽離子性質(zhì)阻止了靜電斥力的融合。
為了直觀地證實(shí)這些結(jié)果，作者用CLSM觀察了第0天和第3天nMT和FMCs的形態(tài)（圖2B）。在第0天，nMT和FMCs分布均勻；特別是體素成像證實(shí)MT被很好地包裹在FMCs中。體素圖像是指對z堆疊圖像中的每個(gè)像素進(jìn)行三維重建，從而創(chuàng)建3D表示。在第3天，由于MT之間的聚集，溶液中的nMT大小增加。相比之下，F(xiàn)MCs的分布保持穩(wěn)定，包埋形式保持良好。進(jìn)行了透射電子顯微鏡檢查，以進(jìn)一步澄清在第3天觀察到的變化（圖2C）。對于以前的結(jié)果，F(xiàn)MCs保持了它們的形態(tài)和分布，但nMT形成了聚集體，有些已經(jīng)被破壞。
上述結(jié)果表明，在體外條件下，F(xiàn)MC提高了MT的物理穩(wěn)定性。然而，由于這些結(jié)果不能顯示包裹在FMC內(nèi)的MT的活性，作者檢查了線粒體細(xì)胞色素C（CytoC）的表達(dá)水平，以評估MTs的活性（圖2D）。眾所周知，當(dāng)細(xì)胞從MT內(nèi)部泄漏到外部時(shí)，細(xì)胞凋亡就開始發(fā)生，當(dāng)MT處于不健康狀態(tài)時(shí)，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞C泄漏。制備nMT和FMC2，在4?C培養(yǎng)一天，第二天（第1天）裂解標(biāo)本并進(jìn)行分析。由于TOMM20的表達(dá)類似于nMT和FMC2，因此可以看出它含有相同數(shù)量的MT。然而，已證實(shí)FMC2的線粒體CytoC表達(dá)水平大約是nMT的兩倍。由于這意味著在nMT中發(fā)生了大量的CytoC滲漏，因此可以判斷存活的可能性很低?；谶@些結(jié)果，證實(shí)了FMC2在體外一天的狀態(tài)下能夠增加MT的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性。
圖2 與nMT比較，評價(jià)FMCs的穩(wěn)定性及其內(nèi)部線粒體的穩(wěn)定性
3、應(yīng)用FMC對線粒體遞送方法的評價(jià)
3.1.FMCS轉(zhuǎn)導(dǎo)脂多糖處理的C28/I2細(xì)胞
接下來，作者使用WST-1試驗(yàn)評估脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的細(xì)胞毒性（圖3A）。通過處理高達(dá)75μg的細(xì)胞來評估三種類型的FC；在這個(gè)劑量下，F(xiàn)C1沒有顯示出細(xì)胞毒性。30μg的FC0和FC2對細(xì)胞的存活率>80%，7.5、15和30μg的FC2對細(xì)胞的存活率最高可達(dá)4h，但沒有明顯的細(xì)胞毒性。此外，作者還將細(xì)胞暴露于FCs（4和8 μg）0.5h和1h，以觀察融合效率。融合后1h的融合效率高于0.5h，8 μg的FCs融合效率高于4μg的FCs，在此基礎(chǔ)上，作者進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)采用8μg的FC劑量。
CLSM驗(yàn)證融合基因MT的傳遞（圖3B）。受體C28/I2細(xì)胞中的MT被染成藍(lán)色，來自供體MSCs的MT被染成綠色，F(xiàn)MCs被標(biāo)記為紅色。受體MTs(藍(lán)色)的熒光強(qiáng)度相似，但來自FMC1和FMC2的供體MTs(綠色)的信號比來自nMTs和FMC0的信號強(qiáng)得多。紅色熒光強(qiáng)度(代表融合效率)也被測量，結(jié)果證實(shí)FMC2表現(xiàn)出最有效的融合MT遞送。
最后，為了定量地驗(yàn)證這一現(xiàn)象，分析了異種MT（圖3C）交付后的mtDNA拷貝數(shù)。由于受體細(xì)胞（C28/I2）是人類來源的，供體（異種）MT是從大鼠來源的成肌細(xì)胞L6細(xì)胞系中分離出來的。4μg MTs給藥后1h，F(xiàn)MC1和FMC2給藥的大鼠細(xì)胞內(nèi)MT比nMT多，4h后以FMC2給藥最多。相比之下，nMT和FMC0遞送的數(shù)量要少得多，1h和4h的水平相似。因此，F(xiàn)MC2是在最短時(shí)間內(nèi)遞送最大數(shù)量MT的平臺(tái)。
通過監(jiān)測與脂多糖處理的C28/I2細(xì)胞的膜融合，作者確認(rèn)FMC2是最有效的MT遞送平臺(tái)（圖3D）。在圖3D中，綠色信號表示質(zhì)膜（PM），青色信號表示傳送的MT，紅色信號表示FMC2。與未經(jīng)處理的（NT）細(xì)胞不同，暴露于nMT和FMC2的細(xì)胞胞漿中含有MT。
此外，暴露于FMC2的細(xì)胞中的綠色和紅色信號重疊，表示膜融合（黃色）。同樣，即使細(xì)胞暴露在空的（無MT）FC2膠囊中，也會(huì)發(fā)生膜融合。綜上所述，這些結(jié)果表明，nMT和FMC0通過內(nèi)吞途徑傳遞，F(xiàn)MC1和FMC2通過膜融合途徑傳遞，提示后一種方法是更有利的策略。
圖3 FMCs的細(xì)胞膜融合比NMT的內(nèi)吞作用提供線粒體的速度更快，數(shù)量更多
3.2 MT的胞內(nèi)和膜融合傳遞途徑的差異
如上所述，有兩種途徑可以將MT通過NMT和FMC2輸送到細(xì)胞中（圖4A）。內(nèi)吞作用是將外來物質(zhì)輸送到細(xì)胞內(nèi)的一種常見機(jī)制；然而，當(dāng)外來物質(zhì)通過內(nèi)吞作用輸送時(shí)，它必須從內(nèi)吞體內(nèi)逃逸，因?yàn)槭Ｏ碌娜魏挝镔|(zhì)都會(huì)被溶酶體移走并降解。因此，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的MT有被降解的風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，由FMCs交付的MT不會(huì)經(jīng)歷這一過程。相反，F(xiàn)MCs與細(xì)胞膜融合，形成一個(gè)通道，允許將包裹的MT直接輸送到細(xì)胞質(zhì)。
用CLSM（圖4B）觀察了用這兩種方法運(yùn)送到細(xì)胞的線粒體的命運(yùn)。線粒體用MitoTracker染成藍(lán)色，早期內(nèi)體（EE）染成綠色，F(xiàn)MC2染成紅色。未觀察到nMT的脂質(zhì)體信號。僅觀察到EE和MT信號。圖4B中的裁剪圖像顯示了EE和MT信號的重疊（青色；由紅色箭頭表示）。此外，直線剖面圖顯示綠色峰和藍(lán)色峰重疊（紅色突出顯示）。相反，F(xiàn)MC2脂質(zhì)體信號遍布細(xì)胞膜，證實(shí)融合發(fā)生，EE和MT信號是分開的（黃色箭頭）。同樣，線條輪廓也不重疊（黃色突出顯示）。這些結(jié)果證實(shí)了NMT通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，F(xiàn)MC2通過膜融合傳遞MT。
nMT和FMC2的關(guān)鍵區(qū)別在于它們通過內(nèi)小體進(jìn)入細(xì)胞，而FMC2通過膜融合傳遞MT。因此，作者接下來檢查了內(nèi)體pH的影響。作為MT膜電位指標(biāo)的JC-1染色證實(shí)，與pH 7.4相比，在pH 5.5（晚期內(nèi)吞體內(nèi)的pH）時(shí)，MT膜電位降低。這意味著MT可能暴露在酸性條件下，導(dǎo)致功能不佳。因此，內(nèi)吞作用并不是MT傳遞的最佳方式。
通常情況下，如果溶酶體中的外來物質(zhì)沒有逃逸，它們會(huì)被溶酶體清除。因此，為了確認(rèn)傳遞的MTs是否被消化在細(xì)胞質(zhì)中，作者將溶酶體染色為綠色，并用CLSM觀察細(xì)胞（圖4C）。對于nMT，大量的MT與溶酶體重疊，形成青色信號（紅色箭頭）；這種重疊被線條輪廓（紅色突出顯示）證實(shí)。這意味著傳遞的MT被溶酶消化。相反，成像和線條輪廓結(jié)果顯示，F(xiàn)MC2信號與MT和溶酶體信號（黃色突出顯示）明顯分開。
線粒體自噬是啟動(dòng)線粒體消化過程的消化器官。基于此，作者認(rèn)為評估線粒體自噬標(biāo)志物的表達(dá)水平將確定轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的線粒體的命運(yùn)（圖4D）。因此，Parkin和LC3B在FMC2中的表達(dá)水平均低于nMT，這是一個(gè)顯著的結(jié)果。這顯示了與圖4C中的結(jié)果相同的圖案?；谶@些結(jié)果，證實(shí)了當(dāng)線粒體通過內(nèi)吞作用遞送時(shí)，相當(dāng)數(shù)量的線粒體被溶酶體或線粒體自噬消化。另一方面，由于FMC2避免了這一過程，可以假設(shè)轉(zhuǎn)移的線粒體有更高的存活機(jī)會(huì)。因此，F(xiàn)MC2作為運(yùn)送線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)體，確保了一條安全的運(yùn)送路線。
通過在低溫（4?C）下抑制細(xì)胞膜活性，作者比較了nMT和FMC2傳遞MT的效率（圖4e）。數(shù)據(jù)顯示，在4?C時(shí)，nMT的效率是37?C的一半。然而，F(xiàn)MC2在這兩種溫度下的效率是一樣的。因此，即使細(xì)胞膜活性降低，F(xiàn)MC2也能傳遞MT。此外，作者比較了內(nèi)吞抑制條件下線粒體的傳遞效率，以證實(shí)FMC通過膜融合傳遞到細(xì)胞的說法。
抑制條件如下：4?C（細(xì)胞膜彈性和三磷酸腺苷合成抑制）、阿米洛利（阿米洛利、巨噬細(xì)胞吞噬抑制）、CPM（氯丙嗪、網(wǎng)織蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞抑制）和FLP（非線菌素、小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞抑制）。抑制內(nèi)吞作用減少了NMT對C28/I2細(xì)胞的輸送。然而，F(xiàn)MC2的交付沒有受到影響。這表明FMC2可以將貨物運(yùn)送到細(xì)胞膜活性較低的細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)再次表明，與細(xì)胞膜融合是一種比內(nèi)吞作用更有利的策略。
圖4 nMT和FMC2使用的線粒體傳遞途徑的差異，以及傳遞的線粒體的命運(yùn)
4、2D OA模型（內(nèi)毒素處理的C28/I2細(xì)胞）線粒體交付后細(xì)胞功能的恢復(fù)
以軟骨細(xì)胞系C28/I2為研究對象，采用體外培養(yǎng)的方法建立骨性關(guān)節(jié)炎模型。用內(nèi)毒素作為損傷誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)OA樣細(xì)胞的形成。已知脂多糖可誘導(dǎo)病理反應(yīng)，如核因子-κB的磷酸化和細(xì)胞內(nèi)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。首先，作者建立了一個(gè)二維OA模型，以確定C28/I2細(xì)胞是否受到內(nèi)毒素的損傷。結(jié)果證實(shí)，內(nèi)毒素刺激后，Ⅱ型膠原（Col II）表達(dá)減少，基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP13）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)增加。研究還證實(shí)，線粒體功能障礙是由ATP含量下降引起的。接下來，作者檢查了MT交付到2D OA模型后細(xì)胞恢復(fù)的程度（圖5A）。nMT和FMC2作用于細(xì)胞后，Col II的表達(dá)增加，而FMC2則降低了MMP13的表達(dá)。這一作用是通過抑制傳遞的MT對NF-κB的磷酸化而實(shí)現(xiàn)的。
用qRT-PCR檢測MT交付后編碼IL-6和TNF-α的mRNA的表達(dá)變化（圖5C），這是已知的OA相關(guān)炎癥因子。結(jié)果表明，MT介導(dǎo)的C28/I2細(xì)胞可減少這些炎癥因子的表達(dá)，表明MT恢復(fù)了最佳的細(xì)胞功能。FMC2的這種影響更加明顯，證實(shí)了FMC2在傳遞MT和減少炎癥方面更有效。
此外，作者還用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測了分泌性炎癥因子的表達(dá)（圖5D）。注射MT后，經(jīng)內(nèi)毒素處理的C28/I2細(xì)胞分泌炎癥因子的能力下降。與上述結(jié)果一致，F(xiàn)MC2比NMT更有效地恢復(fù)受損軟骨細(xì)胞的正常功能。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明MT轉(zhuǎn)移術(shù)是治療骨性關(guān)節(jié)炎的一種有前途的方法。此外，經(jīng)FMC2途徑給藥的細(xì)胞修復(fù)效果好于nMT，提示FMC2是修復(fù)受損軟骨細(xì)胞功能的更有效的方法。
圖5 FMC2介導(dǎo)的線粒體對脂多糖處理的C28/I2細(xì)胞的治療效果的2D模型
5、內(nèi)毒素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞移植后三維培養(yǎng)功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究
將脂多糖處理的C28/I2細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，檢測細(xì)胞的聚集和分化能力。如圖6A所示，內(nèi)毒素處理的C28/I2在三維培養(yǎng)皿中難以形成聚集體。相反，與NT組（未處理組、對照組）相似，nMT和FMC2處理的細(xì)胞能夠形成聚集體，并可以進(jìn)行三維培養(yǎng)。這一趨勢在播種后持續(xù)了10天以上，表明MT不僅能防止脫分化或炎癥，而且還能促進(jìn)細(xì)胞團(tuán)的生長。此外，細(xì)胞聚集體大小的增加表明細(xì)胞增殖或細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生可能已被促進(jìn)。聚集體形成的定量分析表明，MT的存在對細(xì)胞聚集體的數(shù)量有很大的影響，表明MT對脂多糖造成的損傷具有修復(fù)作用。
在3D培養(yǎng)的8天中，作者檢測了編碼Aggrecan（細(xì)胞外基質(zhì)的軟骨成分）、SOX9（轉(zhuǎn)錄因子）、COLX（肥大標(biāo)記）、細(xì)胞外基質(zhì)降解酶MMP3和MMP13以及腫瘤壞死因子α（圖6B）的基因的表達(dá)。在FMC2處理的細(xì)胞中，AGG的表達(dá)水平最高，SOX9的表達(dá)水平與NT相似。此外，脂多糖組和正常對照組均表達(dá)高水平的COLX、MMP3、MMP13和腫瘤壞死因子α，經(jīng)FMC2治療后均顯著下降。
免疫熒光染色顯示，F(xiàn)MC2處理的細(xì)胞SOX9（粉紅色）和Col II（綠色，ECM）的表達(dá)增加，表明脂多糖造成的損傷已被傳遞的MT修復(fù)（圖6C）。此外，F(xiàn)MC2誘導(dǎo)的恢復(fù)比NMT誘導(dǎo)的恢復(fù)更明顯。相反，脂多糖抑制了SOX9和Col II的表達(dá)。這些結(jié)果表明，經(jīng)FMC2注射MT后，受損軟骨細(xì)胞可以恢復(fù)正常功能。
總體而言，這些數(shù)據(jù)表明，MT可以實(shí)現(xiàn)受損軟骨細(xì)胞的功能恢復(fù)，不僅可以緩解炎癥，促進(jìn)組織生成，還可以促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化。這些發(fā)現(xiàn)對開發(fā)新的軟骨再生治療方法具有重要意義。
圖6 3D模型（脂多糖處理的C28/I2球體）評估人工組織形成的程度和FMC2運(yùn)送的線粒體的治療效果
6、骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型注射FMC的實(shí)驗(yàn)研究
通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA建立小鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型，觀察IA注射nMT和FMC2后的組織修復(fù)情況。FMC2注射兩次（Inj.#2）小劑量（LD）每5天注射一次，nMT注射2次（Inj.#2）低劑量或高劑量（HD）和五次（Inj.#5）低劑量（LD）（圖7A）。
在IA注射后第1天，用激光共聚焦顯微鏡觀察nMT和FMC2的定位，以確定它們是否被輸送到軟骨組織（圖7B）。將被輸送到軟骨的MT被標(biāo)記為Mitotracker Deep Red，并進(jìn)行了兩次劑量的測試。在nMT組，在低劑量時(shí)很少觀察到MT信號（綠色），而在高劑量時(shí)僅在一個(gè)狹窄的區(qū)域內(nèi)傳遞。相比之下，在FMC2組中，即使在低劑量時(shí)也能觀察到FMC（紅色）和MT（綠色）信號，而在高劑量時(shí)它們均勻分布在更大的區(qū)域內(nèi)。這些數(shù)據(jù)表明，通過FMC2在體內(nèi)傳遞MT是更好的。
通過檢測血液中炎癥因子的含量，證實(shí)MT的抗炎作用。MIA致炎小鼠血液中的干擾素-γ含量高于野生型（WT）小鼠（圖7C）。然而，當(dāng)MT通過FMC2給藥時(shí)，干擾素-γ的量下降到與WT小鼠相似的水平。這些結(jié)果表明，線粒體通過恢復(fù)受損炎癥組織的正常功能來減輕炎癥。
軟骨組織用藏紅花素-O和阿爾新藍(lán)染色顯示受損的軟骨組織已修復(fù)，如硫酸甘氨酸（橙色）和酸性多糖（藍(lán)色）的表達(dá)增加（圖7D）。組織學(xué)分析注射生理鹽水組（生理鹽水），未見炎性軟骨組織恢復(fù)。然而，通過FMC2傳遞的MT使軟骨組織得以恢復(fù)。這比相同注射次數(shù)的相同劑量的#2 NMT LD恢復(fù)得更好，甚至比注射高劑量MT的#2 NMT HD組更有效。在注射相同劑量的NMT比FMC2更頻繁的NMT組（#5 NMT LD），也觀察到一些軟骨的恢復(fù)。然而，與FMC2相比，多糖（藍(lán)色）和GAGs（橙色）的染色區(qū)域顯得更窄和更弱。這些結(jié)果以量化圖表的形式呈現(xiàn)。
接下來，作者使用Mankin評分評估了MIA誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎模型中軟骨組織損傷的嚴(yán)重程度（圖7E）。Mankin評分系統(tǒng)考慮了軟骨結(jié)構(gòu)和蛋白多糖含量，是評估骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的可靠而有效的方法。FMC2組動(dòng)物的得分與WT組動(dòng)物相似（約2分），但#2 NMT LD組和#2 nMTHD組的得分為11-13分（與生理鹽水對照組相似）。#5 NMT LD的分?jǐn)?shù)約為6分，相當(dāng)于中等嚴(yán)重程度。這些結(jié)果在顯微CT掃描和軟骨下骨體積分析中也得到了證實(shí)。損傷軟骨和軟骨下骨的恢復(fù)率以FMCs最高。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，通過FMC2傳遞的MT在低劑量和低治療頻率下促進(jìn)有效的軟骨組織再生。
圖7 線粒體導(dǎo)入MIA誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎模型小鼠的軟骨穿透與修復(fù)
在這里，作者描述了一種膜融合方法，作為一種通過含有陽離子脂質(zhì)的融合脂質(zhì)體（DOTAP）將MT遞送到靶細(xì)胞的策略。根據(jù)DOTAP比率分析了FMCs的形態(tài)和特性，并對其包封率、穩(wěn)定性和膜融合效率進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果表明，PE：DOTAP比為1：2的FMC2效果最好。作者還進(jìn)行了體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以表明膜融合方法比內(nèi)吞途徑更安全和更快地輸送更多的MT。此外，二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)證實(shí)，在MT交付后，ECM成分的軟骨化表達(dá)增加，炎性細(xì)胞因子的表達(dá)減少。MIA誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎模型證實(shí)，在低劑量和低頻率的治療條件下，F(xiàn)MC2比nMT更有效。因此，穩(wěn)定的MT膜融合遞送系統(tǒng)在恢復(fù)骨關(guān)節(jié)炎受損細(xì)胞或組織的功能方面具有巨大的潛力。
實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)、FC細(xì)胞毒性評價(jià)、nMT和FMC穩(wěn)定性評價(jià)、從供體細(xì)胞分離MT
參考文獻(xiàn)
[1] Kim HR, Cho HB, Lee S, Park JI, Kim HJ, Park KH. Fusogenic liposomes encapsulating mitochondria as a promising delivery system for osteoarthritis therapy. Biomaterials. 2023;302:122350.