病理性高眼壓通過Drp1誘導(dǎo)線粒體功能障礙導(dǎo)致青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞泛凋亡

       泛凋亡作為近年來的研究熱點(diǎn)，是一種細(xì)胞炎癥性程序性死亡，由特定的觸發(fā)器激活，并由泛凋亡復(fù)合體（PANoptosome）調(diào)控，具有焦亡、凋亡和（或）壞死性凋亡的關(guān)鍵特征，但不能單獨(dú)由這三種程序性死亡通路中的任何一種來解釋。下圖是2023年部分關(guān)于泛凋亡的中標(biāo)題目：

       青光眼是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其特征是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）缺失和視野缺損。病理性高眼壓（ph-IOP）是青光眼的重要危險(xiǎn)因素，它會(huì)觸發(fā)控制 RGC 死亡和軸突變性的分子不同級(jí)聯(lián)反應(yīng)。動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1（Drp1）介導(dǎo)的線粒體動(dòng)力學(xué)異常與青光眼發(fā)病機(jī)制有關(guān)。然而，對(duì)調(diào)節(jié)RGC損傷和死亡的確切途徑知之甚少。在這里，我們旨在研究ERK1/2-Drp1-活性氧 （ROS） 軸在 RGC 死亡中的作用以及 Drp1 介導(dǎo)的線粒體動(dòng)力學(xué)與 ph-IOP 損傷中 與泛凋亡之間的關(guān)系。作者研究表明抑制ERK1/2-Drp1-ROS通路是治療ph-IOP誘導(dǎo)損傷的潛在治療策略。此外，抑制 Drp1 可以通過調(diào)節(jié) ph-IOP 模型中 NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡和 RIP介導(dǎo)的細(xì)胞壞死來調(diào)節(jié) RGC泛凋亡。該研究發(fā)表在《Redox Biology》，IF：11.4。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. 氧和葡萄糖剝奪再灌注（OGD/R ）模型誘導(dǎo) R28 細(xì)胞線粒體損傷和死亡

       OGD/R細(xì)胞模型建立：將R28細(xì)胞傳代后更換為無葡萄糖DMEM培養(yǎng)基并且將細(xì)胞置于缺氧室中培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)，然后在正常完全培養(yǎng)基中復(fù)氧1小時(shí)、3小時(shí)或 6 小時(shí)（圖1A）。使用 Hoechst 33342和PI雙重染色檢測發(fā)現(xiàn)OGD/R 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（圖1B和C）。OGD/R 3小時(shí)后，JC-1染色檢測線粒體膜電位發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位下降，預(yù)示著細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡（圖1D和E）。免疫熒光檢測線粒體外膜蛋白Tom20來檢查線粒體形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)OGD/R后線粒體明顯碎片化增加（圖1F和G）。OGD/R 損傷也增加了 線粒體ROS含量，（圖1H）。之后檢測了與線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)的蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)線粒體裂變相關(guān)蛋白Drp1（Ser616）的磷酸化增加。為了探究Drp1（Ser616）激活的上游靶點(diǎn)，我們對(duì)RNA測序（RNA-seq）結(jié)果進(jìn)行了分析，KEGG顯示差異基因在MAPK通路中富集。之后進(jìn)一步驗(yàn)證OGD/R后ERK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) p-Drp1 （Ser616） 和 p-ERK1/2 表達(dá)水平在 OGD/R 后 1 h 達(dá)到峰值，而 Drp1 和 ERK1/2 的表達(dá)基本保持不變 （圖1J 和 M）。證明在 OGD/R 后 3 小時(shí)進(jìn)行了后續(xù)表型研究。這些結(jié)果初步表明，OGD/R模型可以誘導(dǎo)R28細(xì)胞的線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡。

圖1.氧和葡萄糖剝奪再灌注（OGD/R ）模型誘導(dǎo) R28 細(xì)胞線粒體損傷和死亡

2. Drp1抑制劑和敲低Drp1處理減弱了 R28 細(xì)胞中 OGD/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

       siRNA敲低Dpr1方法：將 R28 細(xì)胞鋪板并培養(yǎng)至 30% 匯合度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4 h后，將R28細(xì)胞再培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行OGD/R建模（圖2A）。為了進(jìn)一步確定Drp1介導(dǎo)的線粒體裂變對(duì)OGD/R誘導(dǎo)損傷的影響，在OGD/R模型中分別使用Mdivi-1（Drp1抑制劑）或 siRNA 研究了p-Drp1（Ser616）對(duì)R28細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)使用Mdivi-1或者敲低p-Drp1能夠顯著降低PI陽性細(xì)胞（圖2B和C）。OGD/R誘導(dǎo)的和ATP產(chǎn)量減少在Mdivi-1處理組中部分恢復(fù)（圖2D 和 E。在用Mdivi-1和siRNA處理后，OGD/R誘導(dǎo)的線粒體片段化和mtROS含量顯著降低 （圖2F 和 G、2I 和 J）。說明Mdivi-1或siRNA處理都能夠?qū)€粒體功能產(chǎn)生保護(hù)作用從而緩解細(xì)胞損傷。

圖2.Drp1抑制劑和敲低Drp1處理減弱了 R28 細(xì)胞中 OGD/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

3. ERK1/2介導(dǎo)的 Drp1 Ser616磷酸化調(diào)節(jié)R28細(xì)胞OGD/R誘導(dǎo)損傷期間的線粒體變化

       由于 OGD/R 模型中 p-ERK1/2 顯著升高，接著使用 p-ERK1/2 抑制劑 PD98059 來確定它是否可以通過 p-Drp1（Ser616）預(yù)防OGD/R損傷，以闡明 p-ERK1/2 和 p-Drp1（Ser616）之間的關(guān)系。圖3A和B表明實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OGD/R誘導(dǎo)的p-Drp1（Ser616）在PD98059處理后被顯著抑制。Hoechst 33342 和 PI 雙染色結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用 OGD/R 相比，PD98059 或 敲低 p-ERK1/2 顯著提高了細(xì)胞存活率（圖3C和D）。此外，線粒體功能部分恢復(fù)，ATP水平顯著增加（圖3E和F，3I）。此外，PD98059 和敲低 p-ERK1/2減少了線粒體片段化和 mtROS 的產(chǎn)生 （圖3G 和 H、3J 和 K）。這些結(jié)果表明，抑制ERK-Drp1（Ser616）通路通過挽救線粒體功能障礙和清除mtROS產(chǎn)生來防止OGD/R誘導(dǎo)的損傷。

圖3. ERK1/2介導(dǎo)的 Drp1 Ser616磷酸化調(diào)節(jié)R28細(xì)胞OGD/R誘導(dǎo)損傷期間的線粒體變化

4. ph-IOP 損傷誘導(dǎo)的小鼠 中出現(xiàn)RGC 線粒體損傷和細(xì)胞死亡

       HE結(jié)果顯示，ph-IOP組的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)逐漸不規(guī)則，視網(wǎng)膜層明顯疏松無序，RGCs數(shù)量處理隨時(shí)間減少。視網(wǎng)膜GCL和內(nèi)叢狀層（IPL）明顯水腫，48 h視網(wǎng)膜厚度明顯減小，ph-IOP損傷顯著降低視網(wǎng)膜GCL細(xì)胞數(shù)量（圖4A和B），在視網(wǎng)膜石蠟切片的RBPMS免疫熒光染色中也呈現(xiàn)相同趨勢，對(duì)照組標(biāo)記的RGCs數(shù)量更多（圖4C和D）。視網(wǎng)膜 ph-IOP 損傷后 TUNEL 染色陽性細(xì)胞數(shù)量也顯著增加 （圖4E 和 F）。此外，ROS總量在視網(wǎng)膜ph-IOP損傷后24 h達(dá)到峰值，48 h后略有下降。

圖4.ph-IOP 損傷誘導(dǎo)的小鼠 中出現(xiàn)RGC 線粒體損傷和細(xì)胞死亡

5. ph-IOP損傷激活的ERK1/2-Drp1（Ser616）-ROS信號(hào)通路

       在ph-IOP損傷后3 h、6 h、12 h、24 h和48 h檢測小鼠視網(wǎng)膜中ERK1/2和Drp1（Ser616）蛋白的表達(dá)。p-ERK1/2 表達(dá)在 3 h 時(shí)升高，并在 12 h 達(dá)到峰值。同時(shí)，p-Drp1（Ser616）表達(dá)在6 h時(shí)顯著升高，并在24 h時(shí)達(dá)到峰值（圖5A-C）。同時(shí)，RBPMS與p-Drp1（Ser616）和p-ERK1/2共染色進(jìn)行免疫熒光分析，結(jié)果與WB結(jié)果一致（圖5D-G）。p-ERK1/2和p-Drp1（Ser616）的熒光強(qiáng)度分別在12 h和24 h達(dá)到峰值。WB 結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜PD98059治療可降低 ph-IOP 誘導(dǎo)的 p-Drp1（Ser616） 升高 （圖5H 和 I），表明 p-ERK1/2 可能通過 p-Drp1 （Ser616） 在 RGC 損傷中發(fā)揮作用。隨后，Mdivi-1 和 PD98059 分別用于抑制 p-Drp1 （Ser616） 和 p-ERK1/2，顯著降低小鼠視網(wǎng)膜 （圖5J 和 K）。這些結(jié)果表明，ERK1/2-Drp1信號(hào)通路可能促進(jìn)ph-IOP損傷中ROS的產(chǎn)生。

圖5.ph-IOP損傷激活的ERK1/2-Drp1（Ser616）-ROS信號(hào)通路

6. 抑制 ERK1/2-Drp1-ROS 信號(hào)通路可減少 ph-IOP 誘導(dǎo)的小鼠 RGC 損傷

       接下來使用PD98059、Mdivi-1和Mito-TEMPO（ROS抑制劑）研究抑制ERK1/2-Drp1-ROS通路是否可以預(yù)防視網(wǎng)膜形態(tài)損傷和RGC丟失。HE結(jié)果顯示，ph-IOP損傷后24 h，對(duì)照組視網(wǎng)膜GCL的視網(wǎng)膜形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量均有明顯損傷。PD98059、Mdivi-1或Mito-TEMPO治療后，視網(wǎng)膜形態(tài)部分恢復(fù)，隨后GCL細(xì)胞數(shù)量也在一定程度上反彈（圖6A和B）。該結(jié)果通過RBPMS染色（圖6C和D）。對(duì)于平坦的視網(wǎng)膜（圖6E和F）。注射抑制劑后，TUNEL陽性RGCs和其他視網(wǎng)膜細(xì)胞的數(shù)量顯著減少（圖6G和H）。此外，PD98059和Mdivi-1治療可防止視網(wǎng)膜 ATP 的耗竭。ph-IOP損傷后視網(wǎng)膜ATP含量明顯低于正常組。抑制劑處理后ATP含量顯著升高（圖6I 和J）。Mdivi-1 和 PD98059 治療保留了 ph-IOP 損傷后GCL中線粒體結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因?yàn)檫@些組中結(jié)構(gòu)混亂的線粒體數(shù)量較低（圖6K).

圖6.抑制 ERK1/2-Drp1-ROS 信號(hào)通路可減少 ph-IOP 誘導(dǎo)的小鼠 RGC 損傷

7.使用Mdivi-1抑制Drp1或siRNA 處理可挽救 ph-IOP 誘導(dǎo)的 RGC 泛凋亡

       玻璃體內(nèi)注射Drp1 siRNA敲低Drp1，siRNA注射72 h后構(gòu)建ph-IOP模型，以闡明Drp1在ph-IOP誘導(dǎo)的青光眼中的作用。檢查siRNA治療后的視網(wǎng)膜形態(tài)和RGC細(xì)胞丟失，發(fā)現(xiàn)si-Drp1有效地挽救了ph-IOP誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷和RGC丟失（圖7A-D）。WB結(jié)果顯示，與對(duì)照+NC組相比，si-Drp1顯著降低試驗(yàn)組p-Drp1（Ser616）表達(dá)（圖7E 和 F）。為了研究Drp1與RGCs的泛凋亡的關(guān)系，我們采用WB和免疫熒光法分析了泛凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。WB 結(jié)果顯示，在敲低Dpr1后，細(xì)胞凋亡標(biāo)志物（cleaved-caspase3）（圖 7J）、細(xì)胞焦亡（NLRP3/caspase1/GSDMD）（圖7G–I）和壞死性凋亡（p-RIP1/p-RIP3/p-MLKL）（圖7K-M）顯著下調(diào)。使用 Mdivi-1在處理ph-IOP模型小鼠，WB和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，Mdivi-1或si-Drp1處理后GCL中cleaved-caspase3、caspase1和p-MLKL表達(dá)水平顯著降低（圖8A-C）?？偟膩碚f，作者認(rèn)為推斷Drp1參與調(diào)節(jié) ph-IOP 誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞泛凋亡（圖9)。

圖7&8.使用Mdivi-1抑制Drp1或siRNA 處理可挽救 ph-IOP 誘導(dǎo)的 RGC 泛凋亡

圖9.ph-IOP - 通過 ERK1/2-Drp1-ROS 信號(hào)通路誘導(dǎo) RGC 死亡

結(jié)論

       作者發(fā)現(xiàn)抑制ERK1/2-Drp1-ROS通路是治療ph-IOP誘導(dǎo)損傷的潛在治療策略。為可能的保護(hù)性干預(yù)措施提供了新的見解，這些干預(yù)措施可以調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)以提高RGC的存活率。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)，大鼠氧-葡萄糖剝奪/再灌注（OGD/R）模型，小鼠p-IOP模型，Hoechst 33342/碘化丙啶（PI）雙染色測定，免疫熒光（IF）染色，透射電子顯微鏡（TEM），蛋白質(zhì)印跡（WB）分析，RNA測序（RNA-seq）及數(shù)據(jù)分析，HE染色，TUNEL染色測定，三磷酸腺苷（ATP）測量，小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染，線粒體膜電位測定，ROS檢測

參考文獻(xiàn)

Zeng Z, You M, Fan C, Rong R, Li H, Xia X. Pathologically high intraocular pressure induces mitochondrial dysfunction through Drp1 and leads to retinal ganglion cell PANoptosis in glaucoma. Redox Biol. 2023 Jun; 62:102687. doi: 10.1016/j.redox.2023.102687.