從不吸煙者與吸煙者肺腺癌的獨(dú)特

       盡管吸煙是肺癌最重要的危險(xiǎn)因素之一，但仍有大約 25% 的肺癌患者一生中吸煙少于 100 支，這被定義為從不吸煙者 （LCINS） 的肺癌。與吸煙者肺癌 （LCIS） 相比，LCINS 表現(xiàn)出獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)，包括較低的腫瘤突變負(fù)荷 （TMB）、以 C>T 為主的核苷酸堿基替換以及更頻繁的 EGFR、ERBB2、ALK 和 ROS1 體細(xì)胞改變。這些基因改變的普遍性為L(zhǎng)CINS的靶向治療帶來(lái)了更多益處，這可能部分解釋了LCINS患者更好的預(yù)后。然而，LCINS對(duì)抗程序性死亡配體1（PD-L1）免疫療法的反應(yīng)要差得多，這表明LCINS的腫瘤微環(huán)境（TME）可能與LCIS不同。因此，了解LCINS的復(fù)雜TME有助于改進(jìn)其精準(zhǔn)的治療策略。本文解釋了兩種患者見不同的免疫微環(huán)境，于2023年9月發(fā)表《Cell Reports Medicine》，IF=14.3。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1、從不吸煙的LUAD患病率增加

       為了表征從不吸煙的LUAD，作者首先對(duì)2009年1月至2016年12月在四川大學(xué)華西醫(yī)院診斷為L(zhǎng)UAD的8,396名中國(guó)患者進(jìn)行了分析。超過(guò)一半的患者(59.4%)從不吸煙，在所有LUAD病例中，這一比例在8年內(nèi)呈上升趨勢(shì)。與吸煙者的LUAD相比，從不吸煙者的LUAD在女性中更為常見，且診斷年齡較輕，與其他研究相似。在預(yù)后方面，不吸煙者的總生存期(OS)明顯優(yōu)于吸煙者，這也是先前報(bào)道的。多因素Cox回歸分析顯示，存在吸煙史是LUAD患者較差OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(危險(xiǎn)比[HR]， 1.31;95%置信區(qū)間[CI]， 1.17-1.46;P < 0.001)。此外，與先前的研究一致，對(duì)LUAD基因改變的分析表明，EGFR突變?cè)趶牟晃鼰煹腖UAD中更為常見，而KRAS在吸煙者中更常發(fā)生突變(7.5% vs. 21.8%， p < 0.001)。此外，從不吸煙的LUAD患者PD-L1表達(dá)明顯低于吸煙者(陰性[<1%]，80.2% vs 65.7%， p < 0.001;低表達(dá)[1% ~ 49%]，15.0% vs. 20.7%， p < 0.001;高表達(dá)[R50%]， 4.8%比13.6%，p < 0.001)，支持不吸煙LUAD患者對(duì)抗pd - l1免疫治療的反應(yīng)較差。綜上所述，從不吸煙的LUAD表現(xiàn)出與吸煙者不同的臨床和分子特征，突出了在單細(xì)胞分辨率下探索從不吸煙的LUAD的TME的重要性。

2、LUAD單細(xì)胞表達(dá)圖譜及細(xì)胞類型鑒定

       為了闡明不吸煙者LUAD的不同TME，對(duì)22例LUAD患者(13例不吸煙者和9例吸煙者)的腫瘤標(biāo)本及其可用的遠(yuǎn)端正常肺組織進(jìn)行了scRNA-seq(圖1A)。首先，作者進(jìn)行了1021個(gè)基因面板靶向區(qū)域測(cè)序(TRS)，以在基因組水平上確認(rèn)入組患者的吸煙狀況。與以往的研究一致，本研究中從不吸煙的LUAD比吸煙的LUAD有更多的EGFR突變(84.6% vs. 25.0%， p = 0.018)，更少的KRAS突變(0.0% vs. 25.0%， p = 0.058)， TMB更低(中位數(shù)，3.36 vs. 4.80突變/ Mb, p = 0.08)(圖1B和7C)。因此，作者納入的樣本代表了具有明確吸煙狀態(tài)的LUAD，對(duì)這些樣本進(jìn)行scRNA-seq調(diào)查將有助于研究不吸煙者和吸煙者LUAD之間TME的差異。從不吸煙者/吸煙者的腫瘤組織和正常肺組織分別稱為tNS/tS和nNS/nS?；诘湫蜆?biāo)記基因的表達(dá)，作者將165,753個(gè)質(zhì)量控制通過(guò)的細(xì)胞分為八種主要細(xì)胞類型(圖1C-1E)，包括上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞、自然殺傷[NK]細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和肥大細(xì)胞)和基質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)。作者發(fā)現(xiàn)不同患者的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞按細(xì)胞類型聚集在一起，而上皮細(xì)胞在不同患者之間表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性(圖1C)。鑒定出的最豐富的細(xì)胞是T/NK淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞(圖1C)。此外，作者證實(shí)腫瘤組織中NK細(xì)胞比例低于正常肺組織，B淋巴細(xì)胞比例高于正常肺組織(圖1F)，表明TME激活了適應(yīng)性免疫反應(yīng)。值得注意的是，tNS中的NK細(xì)胞比tS中的NK細(xì)胞下降得更明顯，這表明從不吸煙的LUAD的TMEs更有可能損害NK細(xì)胞的歸巢。

圖1、從不吸煙者和吸煙者luad的突變景觀和綜合單細(xì)胞圖譜

3、從不吸煙的LUAD內(nèi)癌細(xì)胞的侵襲性較低

       共獲得腫瘤和正常肺組織上皮細(xì)胞24,965個(gè)。其中，來(lái)自正常肺組織的上皮細(xì)胞進(jìn)一步聚集成5個(gè)不同的亞型，包括肺泡I型(AT1: AGER和RTKN2)、肺泡II型(AT2: SFTPC和SFTPD)、基底(KRT15和KRT17)、纖毛細(xì)胞(FOXJ1、CAPS和TPPP3)和俱樂部細(xì)胞(SCGB1A1)，以及一個(gè)未定義的與俱樂部、纖毛細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)基因高表達(dá)的群體(CCL4、CD52、CORO1A和CXCR4)?？紤]到腫瘤組織中可能存在殘留的非惡性細(xì)胞，我們采用推斷拷貝數(shù)變異(inferering copy number variation, inferCNVs)來(lái)區(qū)分癌細(xì)胞和非惡性細(xì)胞。來(lái)自腫瘤組織的非惡性細(xì)胞與來(lái)自正常肺組織的上皮細(xì)胞重疊(圖2A和2B)。我們觀察到不同患者的癌細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的異質(zhì)性，而正常肺組織的上皮細(xì)胞則沒有異質(zhì)性(圖2A、2B)。為了明確癌細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞之間的差異，我們?cè)陔S后的分析中將這些非惡性細(xì)胞從腫瘤組織中排除。肺泡細(xì)胞包括AT1和AT2亞型，其中后者被認(rèn)為是LUAD的起源。先前的研究表明，AT2細(xì)胞作為干細(xì)胞樣祖細(xì)胞，參與肺泡更新、修復(fù)和癌變。利用已建立的AT2標(biāo)記基因，包括SFTPB、SFTPC、SFTPD和SFTA3，我們比較了四種組織類型(tNS、tS、nNS和nS)中AT2特征的表達(dá)。結(jié)果顯示，腫瘤組織(tNS/tS)表達(dá)的AT2信號(hào)低于正常肺組織(nNS/nS)(圖2C)。此外，無(wú)論是腫瘤組織還是正常肺組織，吸煙者組織(tS/nS)的AT2信號(hào)均低于非吸煙者組織(tNS/nNS)。通過(guò)AT2細(xì)胞標(biāo)記物SFTPC的多重免疫組織化學(xué)(mIHC)染色(圖2D)和已發(fā)表的LUAD單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析(GEO: GSE131907)。考慮到吸煙引起肺上皮損傷，是肺癌的明確外源性致癌物，我們的研究結(jié)果表明，吸煙引起正常肺上皮細(xì)胞的損傷。此外，我們探討了AT2標(biāo)記是否是患者生存的臨床相關(guān)生物標(biāo)志物，并在癌癥基因組圖譜(TCGA) LUAD大量RNA-seq數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)AT2標(biāo)記的高表達(dá)與改善的OS之間存在顯著關(guān)聯(lián)(p = 0.0045)，這可以部分解釋不吸煙的LUAD患者預(yù)后較好。為了加深我們對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征的理解，我們利用Seurat FindMarkers功能，分別鑒定出14個(gè)上調(diào)的tNS特征基因和30個(gè)上調(diào)的tS特征基因(圖2E)。其中，tNS特征中的4個(gè)基因(CTSH、LPCAT1、GPR116和PABPC1)和tS特征中的1個(gè)基因(MIF)通過(guò)免疫組化(IHC)分析得到驗(yàn)證(圖2F)。GO富集分析顯示，不吸煙者和吸煙者的LUAD參與不同的信號(hào)通路。例如，tNS信號(hào)與表面活性劑的穩(wěn)態(tài)和磷脂的生物合成和代謝有關(guān)，而tS信號(hào)與腫瘤的生物學(xué)特性有關(guān)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，這意味著tS癌細(xì)胞更具侵襲性。此外，tS特征的高表達(dá)與不利的生存相關(guān)(p = 0.043;圖2 g)。為了進(jìn)一步放大癌細(xì)胞，我們對(duì)所有癌細(xì)胞進(jìn)行了亞聚類，得到了16個(gè)聚類。大多數(shù)來(lái)自吸煙者的細(xì)胞聚集在一個(gè)病人身上，而一些來(lái)自不吸煙者的細(xì)胞聚集在幾個(gè)病人身上。這表明吸煙者的癌細(xì)胞比不吸煙者表現(xiàn)出更強(qiáng)的異質(zhì)性(圖2H-2J)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)C9集群包含來(lái)自17例患者的癌細(xì)胞，其中大部分來(lái)自從不吸煙的LUAD，這表明C9的表達(dá)模式可能部分代表了從不吸煙的LUAD中癌細(xì)胞的共同特征。為了破譯C9的轉(zhuǎn)錄特征，我們進(jìn)行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)C9中上調(diào)的基因參與抗原加工和遞呈，特別是通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體(MHC) II類。我們進(jìn)一步用MHC-II標(biāo)記基因?qū)γ總€(gè)癌細(xì)胞簇進(jìn)行評(píng)分，觀察到C9具有明顯更高的MHC-II標(biāo)記評(píng)分(圖2K)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)另外兩個(gè)tNS簇C3和C15(圖2K)也表現(xiàn)出高M(jìn)HC-II特征。此外，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)自tNS的癌細(xì)胞具有更高的MHC-II表達(dá)，這通過(guò)tNS和tS樣品的mIHC染色以及LUAD (GSE131907)公布的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析得到了驗(yàn)證。先前的研究表明，腫瘤特異性MHC-II分子與腫瘤腫塊中更好的CD4+ T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和活化相關(guān)。在我們的研究中，我們還發(fā)現(xiàn)tNS中存在比tS中更高比例的初始和活性CD4+ T淋巴細(xì)胞(圖7B左)，這表明從不吸煙LUAD的癌細(xì)胞可能促進(jìn)腫瘤腫塊中更好的CD4+ T細(xì)胞浸潤(rùn)和激活，從而引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。鑒于癌細(xì)胞上MHC-II的高表達(dá)與癌癥患者良好的預(yù)后相關(guān)，不吸煙LUAD患者癌細(xì)胞中MHC-II的高表達(dá)可能部分解釋了不吸煙LUAD患者預(yù)后較好的原因。

圖2、從不吸煙者和吸煙者LUAD中癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征的鑒定

4、SPP1hi前細(xì)胞的鑒定及其與MDMs的潛在相互轉(zhuǎn)化

       骨髓細(xì)胞(n = 47,580)被分成20個(gè)簇，隨后根據(jù)經(jīng)典標(biāo)記基因的表達(dá)將其分配到已知的細(xì)胞系:巨噬細(xì)胞(組織常駐巨噬細(xì)胞[TRM;C0, C1, C5, C12, C15]，單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞[MDM;C2, C4, C6, C8, C10, C13])，單核細(xì)胞(CD14+ [C3]和CD16+ [C11]單核細(xì)胞)，樹突狀細(xì)胞(dc;cDC1s [C17]， cDC2s [C7, C14]，活化的dc [C18]和pDCs [C16])和中性粒細(xì)胞(C19)(圖3A, 3B)。在這些細(xì)胞類型中，CD14+和CD16+單核細(xì)胞在腫瘤組織中均缺失(圖3F)。據(jù)報(bào)道，巨噬細(xì)胞包括兩種不同的譜系，TRM和MDM，其中TRM是局部自我更新的，而短期MDM是由成人造血干細(xì)胞產(chǎn)生的，這兩者都在作者的研究中發(fā)現(xiàn)(圖3A)。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)另一個(gè)巨噬細(xì)胞群(C9)具有混合特征，高表達(dá)細(xì)胞周期基因(MKI67、STMN1和TUBB)、TRM標(biāo)記基因(MARCO、FABP4和C1QA)和MDM標(biāo)記基因(APOE、SPP1和CCL2)(圖3B)，因此作者將這個(gè)具有潛在增殖特性的巨噬細(xì)胞群命名為Mixed_mac。為了確定Mixed_mac的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，作者對(duì)三種巨噬細(xì)胞群體(TRM、MDM和Mixed_mac)進(jìn)行了軌跡分析。結(jié)果表明，Mixed_mac細(xì)胞可以分為兩部分:一部分(C9-1)位于靠近TRM的位置，另一部分(C9-2)位于靠近MDM的位置(圖3C)。兩個(gè)種群間基因表達(dá)差異分析表明，C9-1高水平表達(dá)TRM標(biāo)記基因(FABP4、MARCO和INHBA)，而C9-2高水平表達(dá)MDM標(biāo)記基因(SPP1)(圖3D);因此，作者將Mixed_mac的這兩個(gè)種群分別命名為FABP4hi pro和SPP1hi pro。總的來(lái)說(shuō)，作者研究中的巨噬細(xì)胞分為四個(gè)種群(TRM、MDM、FABP4hi pro和SPP1hi pro)，它們的轉(zhuǎn)錄模式不同(圖3E)。進(jìn)一步分析這四種巨噬細(xì)胞群的分布，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中TRM比正常肺組織少，MDM比正常肺組織多(圖3F)，與前期研究一致。此外，與nS相比，tS組的TRM顯著降低，而tNS組和nNS組之間沒有明顯變化(圖3F)，通過(guò)患者樣本中CD68+ FABP4+細(xì)胞的mIHC染色證實(shí)了這一點(diǎn)(圖3G)。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)FABP4hi pro和TRM具有相似的分布(圖3F)， SPP1hi pro在四種組織類型中表現(xiàn)出與MDM相同的趨勢(shì)(圖3F和3H)。根據(jù)作者的軌跡結(jié)果(圖3C)、骨髓細(xì)胞的UMAP圖(圖3A和S5A)以及這四種巨噬細(xì)胞群體的分布趨勢(shì)(圖3F)，作者得出結(jié)論，F(xiàn)ABP4hi pro可能會(huì)刷新TRM，證實(shí)了TRM的更新能力。同樣，作者推斷SPP1hi pro可以生成MDM。鑒于據(jù)報(bào)道MDM僅來(lái)源于單核細(xì)胞，作者對(duì)MDM、SPP1hi pro和單核細(xì)胞進(jìn)行了軌跡分析。結(jié)果顯示，SPP1hi前細(xì)胞和單核細(xì)胞都可能是MDMs的獨(dú)立來(lái)源(圖3I)。此外，SPP1hi前細(xì)胞主要存在于腫瘤組織中，尤其是在tNS樣本中(圖3H)，這表明SPP1hi前細(xì)胞在TME中產(chǎn)生更多MDM，從而促進(jìn)LUAD的發(fā)生，特別是對(duì)于從不吸煙的患者。

圖3、骨髓細(xì)胞SPP1hi前細(xì)胞的鑒定

5、從不吸煙的LUAD內(nèi)的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更多的免疫抑制特性

       巨噬細(xì)胞具有很高的可塑性，通常極化為兩種表型，即“經(jīng)典活化”的M1和“交替活化”的M2。M1巨噬細(xì)胞被認(rèn)為具有促炎和抗腫瘤的表型，而M2巨噬細(xì)胞具有抗炎和促腫瘤的作用。利用M1/M2標(biāo)記基因，作者證實(shí)了LUADs中M1和M2巨噬細(xì)胞共存(圖4A)。腫瘤組織中TRM和MDM的M1評(píng)分均低于正常組織，M2評(píng)分均高于正常組織(圖4B-4E)，說(shuō)明TRM和MDM在LUAD中具有免疫抑制作用。此外，作者發(fā)現(xiàn)tNS中TRM的M2評(píng)分高于tS(圖4E)，這是由于tNS中CTSA、CTSB、CTSC、CTSD和CCL18等部分M2標(biāo)記基因的表達(dá)較高(圖4F)。此外，在4種組織類型中，TRM的抗炎評(píng)分與M2評(píng)分的趨勢(shì)相似(圖4G和4H)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明TRMs在從不吸煙的LUAD中發(fā)揮更強(qiáng)的免疫抑制和促腫瘤作用。巨噬細(xì)胞作為抗原呈遞(AP)細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著重要作用。根據(jù)AP標(biāo)記基因，作者計(jì)算AP評(píng)分，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)的TRM/ MDMs評(píng)分高于正常肺組織(圖4I和圖4J)，表明腫瘤適應(yīng)性免疫被激活。此外，作者發(fā)現(xiàn)tNS中的TRMs和MDMs的AP評(píng)分明顯低于tS(圖4I和4J)，這表明在不吸煙的LUAD中存在以巨噬細(xì)胞為代表的免疫抑制微環(huán)境?；谏鲜鯯PP1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，作者觀察到兩個(gè)MDM集群(C2, C10)的細(xì)胞表達(dá)SPP1水平顯著升高，并將其命名為SPP1hi MDM。值得注意的是，這個(gè)MDM子集幾乎只存在于腫瘤樣本中，這促使作者探索它對(duì)LUAD TME的影響。作者比較了tNS和tS的特異性特征(M1、M2、抗炎和AP)評(píng)分。結(jié)果顯示，與tS相比，tNS的M1和AP評(píng)分較低，M2和抗炎評(píng)分較高(圖4K)，表明SPP1hi MDM在不吸煙LUAD的TME中發(fā)揮了更大的免疫抑制和致瘤作用。此外，SPP1hi MDM在tNS中的免疫抑制作用進(jìn)一步被其更高的PD-L1表達(dá)所證實(shí)(圖4L)， PD-L1是抗PD-L1免疫治療應(yīng)答的生物標(biāo)志物。綜上所述，非吸煙LUAD患者的TRM和MDM均比吸煙LUAD患者表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫抑制作用。

圖4、LUAD中巨噬細(xì)胞群體的特征

6、T/NK細(xì)胞在從不吸煙的LUAD中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤免疫抑制

       作者對(duì)80,194個(gè)T/NK細(xì)胞進(jìn)行了亞聚類，以鑒定CD4+ T淋巴細(xì)胞(原生CD4+、活性CD4+、調(diào)節(jié)性T [Treg])、CD8+ T淋巴細(xì)胞(GZMB CD8+、GZMK CD8+和耗散T細(xì)胞)和NK細(xì)胞(CD16+和CD16 )(圖5A、5B)。在這些細(xì)胞中，Treg細(xì)胞在腫瘤組織中增加(圖5C)，與其他報(bào)道相似。此外，Treg細(xì)胞在tNS中比在tS中顯著增加(圖5D)，這可以解釋為tNS中有更多的TRM(圖3F)，因?yàn)閾?jù)報(bào)道TRM可以招募、分化和擴(kuò)增Treg細(xì)胞。CD16+ NK細(xì)胞作為細(xì)胞毒性NK細(xì)胞的主要亞群，在腫瘤組織中呈下降趨勢(shì)，尤其是在tNS中(圖5C)。結(jié)合作者之前觀察到的NK細(xì)胞在tNS中的下降更為顯著(圖1E)，作者推斷NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫受損與數(shù)量減少和功能受損都有關(guān)。然而，GZMK+和耗盡的CD8+ T細(xì)胞在腫瘤組織和正常組織中均無(wú)顯著差異(圖5C)。CD8+ T淋巴細(xì)胞主要通過(guò)分泌GZMB、GZMK、GZMH、GZMM等顆粒酶發(fā)揮細(xì)胞毒作用。其中，GZMB具有最大的細(xì)胞毒能力。作者發(fā)現(xiàn)，GZMK CD8+ T細(xì)胞在腫瘤組織和正常組織之間沒有顯著差異，但GZMB CD8+ T細(xì)胞在腫瘤組織中明顯減少，尤其是在tNS中(圖5C)，這表明細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞的適應(yīng)性免疫反應(yīng)在從不吸煙的LUAD中比吸煙者受到更大的抑制。為了進(jìn)一步探討不吸煙者和吸煙者LUAD患者GZMB CD8+ T細(xì)胞中的異常分子，作者進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)tNS患者GZMA和GZMH的表達(dá)升高(圖5E-5G)。根據(jù)顆粒介導(dǎo)的細(xì)胞毒性標(biāo)記基因，作者發(fā)現(xiàn)與tS相比，tNS中GZMB CD8+ T細(xì)胞GZMB的表達(dá)較低，而GZMA、GZMH和GZMM的表達(dá)較高(圖5G)。這些結(jié)果表明，GZMB CD8+ T細(xì)胞在tNS中數(shù)量顯著減少，但其功能可能受損。此外，GZMK CD8+ T細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞毒性標(biāo)志物(GNLY、NKG7和FGFBP2)水平低于GZMB CD8+淋巴細(xì)胞，但同時(shí)表達(dá)了一定水平的衰竭標(biāo)志物(LAG3和PDCD1)(圖5B)。據(jù)報(bào)道，GZMK CD8+亞群是小鼠和人類炎癥老化的標(biāo)志，因此GZMK CD8+ T群可能代表LUAD中從效應(yīng)T細(xì)胞到耗竭T細(xì)胞的過(guò)渡狀態(tài)。

圖5、LUAD中T/NK淋巴細(xì)胞對(duì)促腫瘤表型的重編程

7、間質(zhì)細(xì)胞在非吸煙者和吸煙者LUAD中發(fā)揮不同的促腫瘤作用

       組織中的基質(zhì)細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和成纖維細(xì)胞。首先，作者確定了五種不同的ECs亞型，包括淋巴型、尖端型、莖型和腫瘤型ECs以及內(nèi)皮祖細(xì)胞(圖6A和6B)。與以往研究一致，作者也發(fā)現(xiàn)腫瘤ECs主要存在于腫瘤組織中(圖6C)。為了更深入地了解ECs，作者進(jìn)行了基因集變異分析(GSVA)來(lái)比較腫瘤和正常肺組織中ECs的表達(dá)譜(圖6D)。腫瘤組織中最富集的通路包括上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、Wnt/b-catenin信號(hào)傳導(dǎo)和血管生成，這可能有助于LUAD的進(jìn)展。作者進(jìn)一步比較了tNS和tS樣品中ECs的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)tS的ECs中肌生成通路上調(diào)，而tNS的ECs中凋亡通路上調(diào)(圖6E)，提示ECs在不吸煙者和吸煙者LUAD中發(fā)揮不同的作用。在作者的數(shù)據(jù)中確定了9種不同亞型的成纖維細(xì)胞(圖6F和6G)，包括COL13A1+、炎性成纖維細(xì)胞、脂肪成纖維細(xì)胞、間皮細(xì)胞、mmp -高、肌成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和通用P16+成纖維細(xì)胞。此外，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中肌成纖維細(xì)胞比正常肺組織多(圖6H)，支持肌成纖維細(xì)胞作為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。GSVA分析顯示，與正常肺組織相比，腫瘤組織中血管生成通路豐富(圖6I)。此外，肌生成在tNS樣本中不富集，而在tS樣本中富集(圖6J)，這表明成纖維細(xì)胞在不吸煙者和吸煙者LUAD中的作用不同。

圖6、本研究中鑒定的基質(zhì)細(xì)胞亞群

8、細(xì)胞間相互作用揭示CD47是不吸煙LUAD的免疫治療靶點(diǎn)

       為了描述LUAD TME中的細(xì)胞間通訊，作者首先利用CellPhoneDB構(gòu)建了細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)，以鑒定主要細(xì)胞類型之間配體/受體的表達(dá)，作者發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞(TRM、MDM、FABP4hi pro和SPP1hi pro)與其他細(xì)胞類型，特別是癌細(xì)胞之間存在廣泛的通訊(圖7A)。此外，四種巨噬細(xì)胞亞型在tNS中的含量均高于tS(圖7B，左)。因此，巨噬細(xì)胞對(duì)從不吸煙的LUAD的腫瘤發(fā)展起著更大的作用。臨床中，LCINS對(duì)抗pd - l1免疫治療的敏感性低于LCIS。作者首先分析了非吸煙者和吸煙者LUAD中最常見的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，包括TMB和PD-L1。結(jié)果顯示，與tS相比，tNS的TMB較低(p = 0.08;圖7C)，并且癌細(xì)胞中PDL1的表達(dá)較低(p < 2.22e 16;圖7D)，經(jīng)mIHC顯微鏡驗(yàn)證(圖7F)。這些結(jié)果可以解釋不吸煙的LUAD患者對(duì)抗pd - l1免疫治療的不滿意反應(yīng)。為了探索不吸煙LUAD的更好的免疫治療策略，作者檢測(cè)了不同細(xì)胞類型中免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)。與PD-L1相比，CD47和CEACAM1在癌細(xì)胞上的表達(dá)明顯升高。有趣的是，CD47的配體SIRPA在四種巨噬細(xì)胞亞型(MDM、SPP1hi pro、TRM和FABP4hi pro)上的表達(dá)比其他免疫細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞高得多(圖7B，右)。此外，值得注意的是，從不吸煙的LUAD患者癌細(xì)胞的CD47表達(dá)高于吸煙者(圖7E)，這一點(diǎn)通過(guò)mIHC染色得到了驗(yàn)證(圖7F)。根據(jù)作者的觀察，四種巨噬細(xì)胞亞型在tNS中比在tS中存在更多(圖7B，左)，作者得出結(jié)論，免疫檢查點(diǎn)CD47-SIRPA軸可能在從不吸煙的LUAD中發(fā)揮更大的免疫抑制作用。重要的是，抗cd47抗體在實(shí)體腫瘤(包括肺癌)中的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。由于癌細(xì)胞中MHC-I分子表達(dá)較低的腫瘤對(duì)抗cd47抗體更敏感，作者比較了tNS和tS之間MHC-I分子的表達(dá)，結(jié)果顯示tNS的MHC-I分子(HLA-A, HLA-B和HLA-C)的表達(dá)較低(圖7G)，這意味著從不吸煙的LUAD可以從抗cd47免疫治療中獲益更多。因此，CD47可能是LUAD的潛在免疫治療靶點(diǎn)，特別是對(duì)于從不吸煙的LUAD。

圖7、LUAD中細(xì)胞類型間的細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)

結(jié)論

       總之，在從不吸煙的LUAD中，癌細(xì)胞表現(xiàn)出較少的侵襲作用，而免疫環(huán)境表現(xiàn)出更多的免疫抑制作用。此外，一種名為SPP1hi pro的巨噬細(xì)胞亞型被發(fā)現(xiàn)是TME內(nèi)另一種獨(dú)立的MDM來(lái)源，它具有免疫抑制作用。重要的是，靶向CD47-SIRPAa免疫檢查點(diǎn)軸可能是治療不吸煙luad的更好的免疫治療策略。因此，本研究提高了我們對(duì)不吸煙LUAD的腫瘤發(fā)生機(jī)制的理解，并提供了一種潛在的免疫治療策略。

實(shí)驗(yàn)方法

單細(xì)胞測(cè)序，靶向區(qū)域測(cè)序和基因組數(shù)據(jù)分析，免疫組化（IHC），多重免疫組化（mIHC）染色，基因集變異分析（GSVA），細(xì)胞間相互作用分析

參考文獻(xiàn)

Luo W, Zeng Z, Jin Y, Yang L, Fan T, Wang Z, Pan Y, Yang Y, Yao M, Li Y, Xiao X, Wang G, Wang C, Chang S, Che G, Zhang L, Li Y, Peng Y, Li W. Distinct immune microenvironment of lung adenocarcinoma in never-smokers from smokers. Cell Rep Med. 2023 Jun 20;4(6):101078. doi: 10.1016/j.xcrm.2023.101078IF: 14.3 Q1 . Epub 2023 Jun 9. PMID: 37301197; PMCID: PMC10313938.