METTL3通過激活JAK1/STAT3信號通路促進結(jié)直腸癌進展

        METTL3介導(dǎo)的N6-甲基腺苷（m6A）修飾在多種癌癥中的作用已被闡明，但其在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用的具體機制仍不清楚。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中，上調(diào)的甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）在基因調(diào)控中發(fā)揮依賴于甲基轉(zhuǎn)移酶活性和不依賴于甲基轉(zhuǎn)移酶活性的兩種功能。JAK1和STAT3的增加共同促進p-STAT3信號通路的激活，并進一步上調(diào)包括VEGFA和CCND1在內(nèi)的下游效應(yīng)物的表達，最終導(dǎo)致體外和體內(nèi)癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的增強。機制上， METTL3將m6A沉積在JAK1轉(zhuǎn)錄本的3'非翻譯區(qū)，依靠YTHDF1的識別促進JAK1的翻譯。此外，METTL3被重新分配到STAT3啟動子上，并與NF-κB協(xié)同促進STAT3的轉(zhuǎn)錄，而這是獨立于METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶活性實現(xiàn)的?？傊?，該研究揭示了METTL3作為m6A writer和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的雙重作用，它們在同一信號通路中共同作用，驅(qū)動結(jié)直腸癌惡性發(fā)展。該研究于2023年11月發(fā)表在《Cell Death & Disease》，IF：9.0。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. m6A和METTL3在結(jié)直腸癌中上調(diào)

        為探究m6A機制在結(jié)直腸癌中的作用，研究人員利用Northern點印跡技術(shù)檢測10個配對的癌癥組織和正常組織切片中的總RNA m6A水平。軟件分析表明，與正常組織相比，癌癥組織中的 m6A 水平呈上調(diào)趨勢，這表明 m6A 在結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中起著協(xié)同促進作用（圖 1A）。隨后，利用生物信息學(xué)方法篩選人大腸癌中的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶（METTL3/14、WTAP、FTO和ALKBH5）的表達情況，發(fā)現(xiàn)只有甲基轉(zhuǎn)移酶的催化核心METTL3在癌組織中較正常組織有顯著上調(diào)（圖1B）。更重要的是，轉(zhuǎn)移灶的METTL3表達高于原發(fā)腫瘤（圖 1C），凸顯METTL3與惡性腫瘤的關(guān)系。然后，通過Western印跡和免疫組化染色評估METTL3在臨床樣本中的蛋白水平表達（圖1D、E）。與mRNA分析結(jié)論一致，與配對的正常組織相比，結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移樣本中的METTL3蛋白水平明顯升高。此外，與正常人結(jié)腸上皮細胞（FHC）相比，所有檢測到的人結(jié)直腸癌細胞系都顯示出METTL3表達增加和 m6A 修飾水平上調(diào)（圖 1F，G）。上述數(shù)據(jù)表明，METTL3 和 m6A 的上調(diào)與結(jié)直腸癌的惡性程度和進展有關(guān)。

圖1. m6A和METTL3在結(jié)直腸癌中上調(diào)

2. METTL3在結(jié)直腸癌細胞中的協(xié)同促進作用

        為進一步闡明METTL3介導(dǎo)的m6A靶向基因調(diào)控機制，利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)建立METTL3穩(wěn)定下調(diào)的結(jié)直腸癌細胞。在HCT116和LoVo 細胞系中，METTL3 的敲除效率分別通過實時定量 PCR 和 Western 印跡得到證實（圖 2A，B）。進行細胞增殖、集落形成和MTT試驗。與對照組相比，METTL3 減少的癌細胞對細胞增殖和集落形成有明顯的抑制作用（圖 2C，D）。Transwell顯示，METTL3 基因敲除顯著削弱 HCT116 和 LoVo 細胞的遷移能力（圖 2E）。細胞增殖抑制通常是由細胞周期停滯或細胞死亡引起的。因此，通過流式細胞術(shù)檢測癌細胞的細胞周期和細胞凋亡。與對照組相比，METTL3沉默的細胞中有更多的細胞被抑制在G1/G0期，停留在G2/M期的細胞比例明顯下降（圖2F），但細胞凋亡在這兩組之間沒有觀察到明顯的差異（圖2G）。因此，METTL3可能通過調(diào)節(jié)細胞周期和遷移而發(fā)揮共促進作用，但并不依賴于細胞凋亡。

圖2. METTL3在結(jié)直腸癌細胞中的協(xié)同促進作用

3. 沉默METTL3對JAK1/STAT3信號通路的影響

        考慮到METTL3對RNA修飾的作用，研究人員通過點印跡法檢測METTL3 缺失的癌細胞中RNA m6A的水平。與對照組相比，沉默METTL3后，癌細胞中的m6A水平明顯下降（圖 3A），這與之前的報道一致。為解讀METTL3對m6A 靶基因表達的作用，研究人員對敲除METTL3的HCT116細胞進行甲基化RNA 免疫沉淀和RNA測序（MeRIP-seq）。測序結(jié)果顯示，大部分m6A峰分布在mRNA 3'UTR和翻譯停止點附近的位點，m6A 沉積量最高（圖 3B），這與之前的測序結(jié)果一致。挑出m6A峰值發(fā)生變化（log2 ≥ 1）的基因進行通路富集統(tǒng)計。其中，JAK/STAT 信號通路的出現(xiàn)引起注意（圖3C）。對JAK1/STAT3信號通路的狀態(tài)進行研究，Western印跡結(jié)果顯示，沉默METTL3顯著抑制STAT3在Tyr705 殘基上的磷酸化。令人驚訝的是，在METTL3敲除的癌細胞中也觀察到JAK1和STAT3表達的明顯下降，而對照組則沒有（圖3D）。為明確METTL3調(diào)控JAK1和STAT3的表達是否依賴于其甲基轉(zhuǎn)移酶活性，使用m6A抗體沉淀含m6A修飾的RNA，并對其進行了定量實時PCR檢測。為排除脫靶的可能性，設(shè)計兩種針對 STAT3 不同位點的成對引物。實時 PCR 結(jié)果顯示，敲除METTL3后，帶有m6A修飾的JAK1 mRNA量減少，但帶有m6A修飾的STAT3 mRNA量沒有差異（圖3E），表明 METTL3 可能以一種與 m6A 無關(guān)的方式介導(dǎo) STAT3 的表達。

        隨后，利用CRISPR-Cas9技術(shù)在HCT116中構(gòu)建METTL3基因敲除細胞。經(jīng)過單細胞選擇后，用 Western blot 檢測十個細胞的結(jié)腸，發(fā)現(xiàn)只有結(jié)腸-4（KO-C4）和結(jié)腸-7（KO-C7）顯示出 METTL3 基因敲除效率（圖3F）。對于 JAK1/STAT3通路分析，METTL3 基因敲除細胞的Western印跡檢測結(jié)果與 METTL3 基因敲除細胞的結(jié)果相同（圖3G）。實時 PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，METTL3 基因敲除在 mRNA 水平上顯著下調(diào)STAT3的表達，但對JAK1 mRNA的表達沒有影響（圖 3H）。為進一步驗證 METTL3 介導(dǎo)的對 JAK1 和 STAT3 的調(diào)控并非脫靶效應(yīng)，在METTL3 基因敲除細胞中外源過表達野生型METTL3（WT-METTL3）和失去甲基轉(zhuǎn)移酶活性的突變型 METTL3（D395A/W398A）。發(fā)現(xiàn)，無論是WT-METTL3還是突變體METTL3的過表達都能挽救STAT3的表達，但只有WT-METTL3能挽救JAK1的表達，突變體METTL3的過表達對JAK1的影響減弱（圖 3I）。上述數(shù)據(jù)表明，METTL3以m6A依賴的方式在蛋白水平上調(diào)控JAK1的表達，而不是在mRNA水平上，并影響STAT3 mRNA的表達，從而共同促進結(jié)直腸癌細胞中JAK1/STAT3信號通路的激活。

圖3. 沉默METTL3對JAK1/STAT3信號通路的影響

4. YTHDF1以m6A依賴性方式促進JAK1 mRNA翻譯

        使用蛋白酶抑制劑 MG132 來阻斷蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解。發(fā)現(xiàn)，MG132 處理未能補充METTL3敲除介導(dǎo)的JAK1下調(diào)（圖4A），表明METTL3可能參與JAK1翻譯。在 HCT116 細胞系中構(gòu)建穩(wěn)定沉默YTHDF1的細胞（圖4B）。Western印跡檢測顯示，YTHDF1敲除能有效抑制STAT3磷酸化，降低JAK1的表達水平，但對STAT3的表達沒有影響（圖4C）。進行RNA 相關(guān)免疫沉淀（RIP）和實時定量 PCR（圖 4D），發(fā)現(xiàn)JAK1 mRNA富集在YTHDF1免疫沉淀物中，METTL3基因敲除后，這種相互作用明顯減弱（圖4E，F），突出m6A在YTHDF1和JAK1 mRNA相互作用中的不可或缺性。通過掃描HCT116中的MeRIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)JAK1 mRNA 3'UTR中分布著大量置信度極高的m6A峰，并預(yù)測出4個潛在的m6A位點（圖4G）。將 JAK1 3'UTR 序列克隆到雙熒光素酶 pmirGLO 載體中，并分別構(gòu)建潛在 m6A 位點發(fā)生單堿基替換的突變載體（圖4H）。熒光素酶檢測結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)染位點3和位點4存在m6A突變的載體的細胞，其熒光素酶活性明顯減弱，這意味著位于JAK1 mRNA 3'UTR位點3和位點4的m6A修飾是m6A介導(dǎo)的JAK1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的原因（圖4I）。此外，與對照組相比，YTHDF1的缺失也導(dǎo)致熒光明顯下降（圖4I），這進一步驗證YTHDF1在識別JAK1 m6A位點中的重要作用。上述數(shù)據(jù)表明，METTL3對JAK1表達的調(diào)控功能是通過YTHDF1識別m6A位點來增強靶基因翻譯的能力來實現(xiàn)的。

        然后，研究YTHDF1在結(jié)直腸癌細胞中的作用。沉默YTHDF1明顯抑制細胞增殖和集落形成（圖 4J，K），與對照細胞相比，YTHDF1 缺失細胞的遷移能力也受到影響（圖4L）。此外，流式細胞術(shù)分析表明，停留在M期的細胞比例下降，更多的細胞停滯在S期（圖4M），這與在METTL3沉默細胞中觀察到的結(jié)果一致。綜合上述數(shù)據(jù)，METTL3依賴YTHDF1與JAK1 m6A位點的結(jié)合能力促進JAK1翻譯，導(dǎo)致STAT3通路激活和癌癥進展。

圖4. YTHDF1以m6A依賴性方式促進JAK1 mRNA翻譯

5. METTL3和NF-κB共同調(diào)控STAT3轉(zhuǎn)錄

        使用放線菌素D中斷細胞的RNA合成。實時PCR檢測表明，在放線菌素 D暴露下，METTL3基因敲除組與對照組STAT3 mRNA降解率無明顯差異（圖 5A），說明STAT3 mRNA 降解不受METTL3影響。利用免疫熒光檢測METTL3 在HCT116細胞中的位置，發(fā)現(xiàn)METTL3大部分定位于細胞核中，在細胞質(zhì)中幾乎觀察不到任何信號（圖5B）。隨后，參考已發(fā)表的METTL3和METTL14的ChIP-seq數(shù)據(jù)（GSE141992）進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)METTL3結(jié)合位點在STAT3啟動子特異性地靠近轉(zhuǎn)錄起始點附近非常豐富（圖5C）。令人驚訝的是，在 STAT3 啟動子區(qū)域也發(fā)現(xiàn)NF-κB 的足跡（圖5C），這表明METTL3可能與 NF-κB協(xié)同調(diào)控STAT3的轉(zhuǎn)錄。隨后，在HCT116 細胞中分別對METTL3和 NF-κB進行ChIP 檢測。分離 PCR 產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)STAT3啟動子片段出現(xiàn)在 METTL3和NF-κB沉積物中，而抗IgG組中沒有（圖5D，E），這表明 METTL3/NF-κB與STAT3啟動子直接相互作用。

        隨后，通過共免疫沉淀也證實METTL3與NF-κB之間的直接相互作用（圖5F）。為進一步探討NF-κB是否具有調(diào)控 STAT3 表達的能力，用siRNA抑制癌細胞中NF-κB 的表達，發(fā)現(xiàn) STAT3 的表達適度下降（圖 5H）。此外，在線數(shù)據(jù)挖掘顯示，在臨床病理結(jié)直腸癌樣本中，NF-κB和STAT3的表達呈正相關(guān)（圖5G），這為 NF-κB在調(diào)控 STAT3 表達中的作用提供新的證據(jù)。最后，將包含轉(zhuǎn)錄起始位點上游450 bp和下游40 bp的序列構(gòu)建成啟動子活性檢測質(zhì)粒（圖5I）。此外，構(gòu)建已知NF-κB結(jié)合位點突變的相同序列，并轉(zhuǎn)染到癌細胞中進行啟動子活性檢測。與野生型組相比，NF-κB突變明顯降低STAT3啟動子的活性，而且這種抑制作用在METTL3基因敲除的癌細胞中進一步擴大（圖5I）。上述數(shù)據(jù)共同表明，METTL3和NF-κB協(xié)同促進STAT3的轉(zhuǎn)錄。

圖5. METTL3和NF-κB共同調(diào)控STAT3的轉(zhuǎn)錄

6. p-STAT3 信號失調(diào)的下游效應(yīng)

        對METTL3沉默的癌細胞中VEGFA的表達情況進行調(diào)查。METTL3的缺失在mRNA水平和蛋白水平上都明顯抑制了VEGFA 的表達（圖 6A，B）。根據(jù)研究結(jié)果，METTL3沉默通過誘導(dǎo)細胞周期停滯來抑制細胞增殖。在METTL3 缺失的細胞中，CCND1 的表達明顯下降，同樣的結(jié)果也在YTHDF1沉默的癌細胞中得到證實（圖 6C，D）。這些數(shù)據(jù)表明，METTL3可能通過激活JAK1/STAT3信號通路來調(diào)控VEGFA和CCND1的表達。使用 STAT3小分子抑制劑Stattic 阻斷HCT116癌細胞中STAT3的磷酸化。Western印跡顯示，STAT3的活性受stattic的抑制呈劑量依賴性，其下游因子包括VEGFA和CCND1在stattic處理后也出現(xiàn)下調(diào)（圖6E）。此外，stattic劑量依賴性地影響HCT116癌細胞的集落形成和遷移（圖6F，G）。數(shù)據(jù)庫分析顯示，與正常人群相比，VEGFA、CCND1 和 YTHDF1在結(jié)直腸癌組織中的表達均上調(diào)（圖6H）。在幾乎所有分析的癌癥類型中，METTL3與其靶標(biāo)（包括JAK1、VEGFA、CCND1和STAT3）之間的表達相關(guān)性均為陽性（圖6I）。總之，上述數(shù)據(jù)揭示STAT3 信號通路在METTL3介導(dǎo)的結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。

圖6. JAK1/STAT3 信號失調(diào)的下游效應(yīng)

7. METTL3和YTHDF1促進體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移

        將缺失或未缺失METTL3的結(jié)直腸癌細胞皮下注射到 BALB/c裸鼠體內(nèi)。METTL3基因敲除有效延緩腫瘤生長（圖7A），因為與對照組相比，METTL3 基因缺失組的異種移植物的重量和大小均顯著減少（圖7B、C）。隨后，建立肺轉(zhuǎn)移小鼠模型，尾靜脈注射HCT116對照組細胞會導(dǎo)致嚴(yán)重的肺轉(zhuǎn)移，而缺失METTL3則幾乎完全消除轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成（圖 7D，E）。所有這些都證實 METTL3通過促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移在結(jié)直腸癌發(fā)生中的致癌作用。

        將YTHDF1缺失的癌細胞注射到裸鼠體內(nèi)，建立腫瘤小鼠和肺轉(zhuǎn)移小鼠模型。YTHDF1沉默后，腫瘤負荷明顯減輕（圖7F-H），與對照組相比，注射YTHDF1缺失細胞的小鼠肺組織切片中出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)更少（圖 7I，J）。此外，STAT3 信號相關(guān)蛋白的表達水平在METTL3或YTHDF1缺乏的異種移植物中有所降低（圖7K），這與在細胞中觀察到的結(jié)果一致?？傊芯拷Y(jié)果表明METTL3 以依賴和不依賴 m6A 的方式同時上調(diào)JAK1和STAT3的表達，從而促進STAT3 信號的激活，導(dǎo)致結(jié)直腸癌在體外和體內(nèi)的增殖和進展（圖8）。

圖7. METTL3和YTHDF1促進體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移

圖8. 結(jié)直腸癌細胞中METTL3介導(dǎo)的STAT3信號通路激活示意圖

結(jié)論

        綜上所述，本研究表明，METTL3通過上調(diào)JAK1和STAT3的表達，以m6A 依賴性和非依賴性的方式，促進p-STAT3信號通路的激活，從而促進結(jié)直腸癌的進展。因此，同時抑制p-STAT3 和METTL3可為結(jié)直腸癌治療帶來新的視角。

實驗方法

        細胞培養(yǎng)，細胞增殖和克隆形成實驗，Transwell，細胞周期研究，WB，實時定量PCR，穩(wěn)定敲低和敲除細胞系的建立，m6A點印跡，m6A RNA免疫沉淀，RNA相關(guān)免疫沉淀，ChIP，RNA降解測定，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，熒光素酶檢測，動物模型構(gòu)建

參考文獻

        Sun Y, Gong W, Zhang S. METTL3 promotes colorectal cancer progression through activating JAK1/STAT3 signaling pathway. Cell Death Dis. 2023 Nov 25;14(11):765. doi: 10.1038/s41419-023-06287-w. PMID: 38001065; PMCID: PMC10673931.