單細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦膜淋巴功能障礙的發(fā)病機(jī)制

       蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）是腦卒中中一種致命的亞型，死亡率和致殘率都很高。腦膜淋巴血管（mLVs）是一種新發(fā)現(xiàn)的顱內(nèi)液體運(yùn)輸系統(tǒng)，經(jīng)證實(shí)可將腦脊液中滲出的紅細(xì)胞引流至頸部深部淋巴結(jié)。然而，許多研究報(bào)道了mLVs的結(jié)構(gòu)和功能在幾種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中受到損傷。SAH是否可引起mLVs損傷及其機(jī)制尚不清楚。本文應(yīng)用單細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，結(jié)合體內(nèi)/體外實(shí)驗(yàn)，研究SAH后mLVs的細(xì)胞、分子和空間模式的改變。首先，研究證明SAH誘導(dǎo)mLVs損傷。然后，通過測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)血栓反應(yīng)蛋白1 （THBS1）和S100A6與SAH結(jié)局密切相關(guān)。此外，THBS1-CD47配體受體對被發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)STAT3/Bcl-2信號通路在腦膜淋巴內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。這些結(jié)果首次揭示了SAH后mLVs損傷的情況，并提供了一種基于mLVs通過破壞THBS1和CD47相互作用來保護(hù)SAH的潛在治療策略。該文章于2023年5月發(fā)表在《Advanced Science》，IF：15.1。

技術(shù)路線：

技術(shù)路線圖

主要研究內(nèi)容：

1. SAH后不同時(shí)間進(jìn)程mLVs變化的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

       為了研究SAH后mLVs是否受損，作者通過向交叉前池注射自體血建立實(shí)驗(yàn)性SAH模型。該模型是探索中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴功能的理想模型，因?yàn)樗恍枰耆┞队陬i部解剖結(jié)構(gòu)，可以避免對mLVs的直接影響。此外，在SAH建模后的不同時(shí)間，將熒光珠注射到大池內(nèi)（i.c.m），以進(jìn)一步評估mLVs的引流功能。結(jié)果顯示，早在SAH后3小時(shí)，dCLNs的微珠引流就顯著減少，并且引流障礙一直持續(xù)到損傷后72小時(shí)（圖1B）。對于dCLNs的上游路徑，在SAH后24和72 h， mLVs中也出現(xiàn)了引流減少和結(jié)構(gòu)損傷（圖1I）。

圖1 SAH后不同時(shí)間序列mLVs變化的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

       為了全面闡明SAH后mLVs的細(xì)胞組成變化，作者對不同組（Sham組，SAH 24 h組，SAH 72 h組，每組10只小鼠）的小鼠進(jìn)行了scRNA-seq （10× Genomics）（圖1A）。在原始scRNA-seq數(shù)據(jù)和相鄰的序列分析中排除受損或死亡細(xì)胞和假定的細(xì)胞雙鏈后，共保留30只小鼠的25 536個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，其中9891個(gè)細(xì)胞來自sham組，8262個(gè)細(xì)胞來自SAH 24 h組，7383個(gè)細(xì)胞來自SAH 72 h組（圖1C）。然后，作者根據(jù)測序深度和線粒體reads計(jì)數(shù)對基因表達(dá)進(jìn)行歸一化，并基于細(xì)胞間高可變表達(dá)基因應(yīng)用主成分分析（PCA）。為了糾正批次效應(yīng)，作者將scRNA-seq數(shù)據(jù)與Seurat整合方法進(jìn)行整合。在此基礎(chǔ)上，采用統(tǒng)一流形逼近投影（UMAP）嵌入空間和基于圖的聚類方法對細(xì)胞簇進(jìn)行識別。用眾所周知的標(biāo)記對聚類進(jìn)行注釋。細(xì)胞分為16種主要細(xì)胞類型（圖1C-E），包括以Cd79A、Cd79B和Ms4a1為標(biāo)記的B細(xì)胞，以Ncr1、Klrb1c和Nkg7為標(biāo)記的NKs，以C1qb、Cd68、Csf1r和Mrc1為標(biāo)記的巨噬細(xì)胞，以S100α9、IL1β和Csf3r為標(biāo)記的中性粒細(xì)胞，以Ccr2和Ly6c2為標(biāo)記的單核細(xì)胞，以Cd3d、Cd3e和Cd247為標(biāo)記的T細(xì)胞，以Cd209a和Cd74為標(biāo)記的pDCs，以Fcer1a、Kit和Ms4a2為標(biāo)記的肥大細(xì)胞，以Ttr、Enpp2和Ptgds為標(biāo)記的紅細(xì)胞，以Car2、Hba-a1、Hbb-bs為標(biāo)志的紅細(xì)胞，以Col1a1、Col1a2、Col3a1、DCN為標(biāo)志的間充質(zhì)細(xì)胞，以Birc5、Ube2c為標(biāo)志的上皮細(xì)胞，以Pecam1、Cdh5、Kdr為標(biāo)志的內(nèi)皮細(xì)胞，以Gng13、S100α5為標(biāo)志的前腦神經(jīng)元，以S100b、Cdh2為標(biāo)志的膠質(zhì)細(xì)胞，以Cdh2、Pde6g、Gnb3為標(biāo)志的神經(jīng)前體細(xì)胞。盡管假手術(shù)組和SAH組的mLVs中都出現(xiàn)了所有16種主要細(xì)胞類型（圖1C），但每種細(xì)胞類型的動(dòng)態(tài)變化是不同的。同時(shí)，鑒于mLECs來源于內(nèi)皮細(xì)胞，作者進(jìn)一步對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了聚類分析，得到了三個(gè)亞簇。該結(jié)果顯示，在SAH后24 h， mLVs比例最小（圖1F），說明此時(shí)mLVs損傷可能是最嚴(yán)重的。

       同樣，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，SAH后CD45-CD31+LYVE1+細(xì)胞（mLECs）數(shù)量下降，并且在SAH后24 h發(fā)生最嚴(yán)重的損傷（圖1H）。此外，在幾項(xiàng)神經(jīng)功能測試中，與假手術(shù)組相比，受傷小鼠的改良Garcia評分較低，Tturn和Ttotal延長，缺陷延長，恢復(fù)延遲。綜上所述，這些結(jié)果表明，SAH引起小鼠急性期mLVs結(jié)構(gòu)和引流功能的損傷，并引起神經(jīng)功能的喪失。

2. 空間圖譜的反卷積和細(xì)胞類型相互作用的可視化

圖2 SAH后mLVs空間圖譜的反卷積

       如上所述，scRNA-seq數(shù)據(jù)丟失了每個(gè)細(xì)胞的空間特征。因此，作者隨后結(jié)合ST來提高測序數(shù)據(jù)的完整性，揭示所有細(xì)胞的空間分布。經(jīng)蘇木精和伊紅（H&E）染色和明場成像，mLVs切片發(fā)現(xiàn)明顯的組織學(xué)特征。采用Seurat方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制和降維，通過t分布隨機(jī)嵌入（T-SNE）實(shí)現(xiàn)可視化。基于每個(gè)簇中的差異表達(dá)基因（DEGs），逐步進(jìn)行細(xì)胞聚類，構(gòu)建ST圖譜。在最近的一項(xiàng)研究中提到，作者同樣使用RCTD軟件對每個(gè)組織覆蓋點(diǎn)進(jìn)行反卷積，進(jìn)一步重建了竇解剖的分層和分段結(jié)構(gòu)。預(yù)測的12個(gè)免疫細(xì)胞簇的定位證實(shí)了它們在特定區(qū)域（如上矢狀竇[SSS]，橫竇[TS]和熱點(diǎn)）的富集。作者在SSS和TS上繪制了每個(gè)點(diǎn)內(nèi)每個(gè)細(xì)胞簇的比例作為代表性餅圖（散點(diǎn)餅）。有趣的是，損傷后浸潤到mLVs的免疫細(xì)胞發(fā)生了明顯的變化。與正常mLVs相比，浸潤單核細(xì)胞在SAH后24小時(shí)顯著增加，成為所有細(xì)胞簇中的主要細(xì)胞群。雖然72 h時(shí)浸潤的巨噬細(xì)胞最多，以M2亞型為主，但在熱點(diǎn)部位聚集的單核細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞明顯增多（圖2A）。

       為了進(jìn)一步探討腦膜免疫微環(huán)境的改變，作者試圖將每個(gè)細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)映射到ST，以準(zhǔn)確揭示SAH后免疫細(xì)胞對mLVs的浸潤。免疫細(xì)胞浸潤在SAH后24 h以單核細(xì)胞為主，72 h以巨噬細(xì)胞為主。中性粒細(xì)胞浸潤在24 h達(dá)到峰值，72 h恢復(fù)到正常水平（假手術(shù)）。T細(xì)胞浸潤在損傷后不同時(shí)間進(jìn)程中逐漸增加，而B細(xì)胞浸潤相對穩(wěn)定。損傷后NKs和pDC的浸潤也持續(xù)增加（圖2B）。這些結(jié)果反映了隨著SAH的發(fā)展，mLVs在不同階段的細(xì)胞變化。

3. 細(xì)胞間通訊分析揭示THBS1-CD47配體受體對激活與mLVs損傷相關(guān)

       鑒于免疫炎癥一直被認(rèn)為是SAH發(fā)病的關(guān)鍵病理機(jī)制，作者的研究結(jié)果揭示了sham組和SAH組浸潤免疫細(xì)胞的差異，作者想知道免疫微環(huán)境的動(dòng)態(tài)重塑是否在mLVs損傷中起重要作用。mLECs分布預(yù)測的可視化顯示，損傷后24 h mLECs損傷最嚴(yán)重（圖3A）。因此，作者首先研究了所有細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間通信，以可視化整體情況。通過多種學(xué)習(xí)和定量對比，Cell Chat確定了每個(gè)細(xì)胞簇之間差異過表達(dá)的配體和受體。總共檢測到4239對顯著的L-R對，進(jìn)一步將其分類為2258條信號通路。通過統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，隨機(jī)排列細(xì)胞的組標(biāo)簽，然后重新計(jì)算相互作用概率，確定顯著的相互作用。

       接下來，作者開始尋找mLECs和其他細(xì)胞類型之間的關(guān)系。確定了幾個(gè)對mLECs的輸出或輸入信號模式貢獻(xiàn)最大的信號（圖3B）。綜上所述，損傷后24 h時(shí)mLVs損傷最為嚴(yán)重，單核細(xì)胞在這段時(shí)間內(nèi)以浸潤細(xì)胞為主，說明單核細(xì)胞與mLVs的相互作用可能在mLVs功能障礙中起關(guān)鍵作用。因此，通過關(guān)注mLECs和單核細(xì)胞之間的通信，作者發(fā)現(xiàn)THBS信號通路特別積極地參與所有信號模式。作者進(jìn)一步探索了基于THBS信號作用于mLECs的潛在L-R對，并計(jì)算了這些L-R對的貢獻(xiàn)。其中，L-R對“THBS1-CD47”在細(xì)胞間通訊中表現(xiàn)出最強(qiáng)的相互作用（圖3C）。為了進(jìn)一步評估THBS1-CD47 L-R對的空間分布，作者使用了專門用于分析空間通信的技術(shù)stLearn，該技術(shù)可以將細(xì)胞的空間信息與所有預(yù)測的通信結(jié)合起來，發(fā)現(xiàn)L-R對的區(qū)域特異性。結(jié)合鄰近點(diǎn)之間的L-R共表達(dá)富集和細(xì)胞類型密度富集，發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)的熱點(diǎn)，細(xì)胞類型之間的相互作用最有可能發(fā)生。結(jié)果顯示，THBS1-CD47 L-R對在SAH后24小時(shí)顯著激活（圖3D）。

圖3 mLVs內(nèi)部和周圍的細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)

4. THBS1損害腦膜淋巴引流，加重神經(jīng)功能障礙

       在發(fā)現(xiàn)THBS1-CD47 L-R對可能與mLVs損傷相關(guān)后，作者想要評估SAH后THBS1的影響。作者使用Proteome Xchange Consortium （PXD030593）的質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)檢測SAH后內(nèi)源性THBS1的改變。質(zhì)譜測定的SAH患者腦脊液中差異表達(dá)蛋白顯示THBS1蛋白顯著上調(diào)（作者以正常壓力腦積水（NPH）患者腦脊液樣本作為對照組，圖3E）。鑒于人類THBS家族有THBS1、THBS2和THBS4三種亞型，作者使用ELISA試劑盒再次檢測了SAH患者腦脊液樣本中所有THBS亞型的表達(dá)，以驗(yàn)證THBS1是否是THBS的關(guān)鍵成員。正如作者所料，盡管THBS2和THBS4水平也升高，但與NPH組相比，SAH后THBS1的表達(dá)增加最多（圖3F）。此外，較高的THBS1水平與SAH患者較差的臨床預(yù)后密切相關(guān)（圖6F）。

圖4驗(yàn)證THBS1對SAH后mLVs功能的影響

       然后，作者進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討THBS1在SAH后mLVs損傷中的作用。首先，將低劑量小鼠重組THBS1蛋白注入小鼠大池，觀察mLVs功能的變化。與陰性對照（NC）小鼠相比，重組THBS1 （rTHBS1）蛋白處理導(dǎo)致mLVs和dCLNs中的小珠聚集減少（圖3G，I），mLVs的mLECs數(shù)量減少（圖3H）。其次，作者通過將AAV-THBS1注入小鼠大池構(gòu)建THBS1過表達(dá)小鼠，并培養(yǎng)THBS1-KO小鼠進(jìn)行進(jìn)一步研究。與AAV對照相比，SAH后使用AAV-THBS1治療的mLVs損傷更嚴(yán)重（圖4A-C）。相反，THBS1-KO部分逆轉(zhuǎn)了SAH引起的mLVs損傷（圖4H-J）。此外，神經(jīng)功能測試也給出了類似的結(jié)果。THBS1過表達(dá)加重了SAH引起的神經(jīng)功能缺損，而敲除THBS1可改善神經(jīng)功能（圖4D-G， K-N）。更重要的是，與THBS1敲除的結(jié)果一致，用THBS1抗體阻斷THBS1后，mLVs和神經(jīng)功能損傷也得到逆轉(zhuǎn)（圖5A-G）。綜上所述，這些結(jié)果證明THBS1上調(diào)導(dǎo)致SAH后mLVs結(jié)構(gòu)和引流功能受損，從而加重神經(jīng)行為功能障礙。

5. 干擾THBS1-CD47相互作用通過抑制STAT3/ BCL2介導(dǎo)的mLECs細(xì)胞凋亡促進(jìn)mLVs修復(fù)

       既往研究報(bào)道THBS1通過與其受體CD47結(jié)合抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和趨化作用。同樣，作者的研究結(jié)果預(yù)測了THBS1-CD47 L-R對在mLVs損傷中發(fā)揮重要作用，并證明了THBS1在SAH后的損傷作用。因此，作者繼續(xù)研究CD47的功能。與igG處理相比，在SAH后24小時(shí)用抗體阻斷CD47可減輕腦膜淋巴功能障礙（圖5A-C）。相應(yīng)的，神經(jīng)功能也明顯改善（圖5D-G）。

       接下來，為了進(jìn)一步研究THBS1-CD47相互作用誘導(dǎo)損傷的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了GSEA分析。結(jié)果顯示，損傷24 h后mLECs細(xì)胞凋亡通路明顯激活（圖5H）。Tunel染色顯示SAH后細(xì)胞凋亡明顯激活。THBS1過表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了mLVs的凋亡，而THBS1阻斷導(dǎo)致Lyve1+Tunel+細(xì)胞減少。人單核細(xì)胞與LECs體外共培養(yǎng)證實(shí)，在血紅蛋白（150μm）刺激下，共培養(yǎng)體系上清中THBS1含量顯著增加，說明單核細(xì)胞是SAH后THBS1分泌的來源之一。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與對照組相比，經(jīng)THBS1中和抗體預(yù)處理的共培養(yǎng)體系中LECs的凋亡明顯減少。然而，mLVs損傷的確切機(jī)制尚不清楚。

       研究表明THBS1-CD47相互作用通過干擾內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育所必需的VEGF/VEGFR2信號誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。此外，VEGFR2抑制通過抑制骨肉瘤STAT3/BCL-2信號通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。因此，作者假設(shè)THBS1-CD47相互作用是否可以通過抑制STAT3/BCL-2信號傳導(dǎo)來治療mLECs凋亡。首先，共免疫沉淀（COIP）證實(shí)了LECs中THBS1和CD47之間的相互作用。其次，在原發(fā)性mLECs中，rTHBS1處理后，隨著Bax的表達(dá)增加，pSTAT3和BCL-2的表達(dá)呈劑量依賴性顯著降低（圖5I），表明rTHBS1處理通過抑制STAT3/BCL-2信號通路的激活促進(jìn)mLECs凋亡。最后，在SAH小鼠mLVs樣本中，pSTAT3和BCL-2水平在SAH后24 h達(dá)到峰值，然后在72 h下降，這與GSEA結(jié)果一致（圖5J）。THBS1敲除或阻斷THBS1/CD47均可顯著增加pSTAT3和BCL-2的表達(dá)（圖5K，M），而THBS1過表達(dá)則相反（圖5L）。綜上所述，這些研究結(jié)果證實(shí)THBS1-CD47 L-R對通過STAT3/BCL-2信號通路促進(jìn)mLVs凋亡，抑制這種相互作用可能有助于減輕mLVs損傷。

圖5干擾THBS1-CD47相互作用通過抑制STAT3/ BCL2介導(dǎo)的mLECs細(xì)胞凋亡促進(jìn)mLVs恢復(fù)

6. 擬時(shí)序分析顯示SAH后mLECs的改變痕跡

       此外，作者對不同樣本中的所有mLECs進(jìn)行了擬時(shí)序分析，以揭示SAH后EBI階段mLECs的變化軌跡（圖6A）。用真實(shí)分組信息標(biāo)記mLECs后，作者發(fā)現(xiàn)SAH后24 h mLECs的損傷模式與上述發(fā)現(xiàn)一致。然而，出乎意料的是，與假手術(shù)組和24小時(shí)組相比，72h的mLECs似乎具有完全不同的細(xì)胞狀態(tài)或特征（圖6B）?？紤]到mLECs損傷在SAH后72 h得到部分改善（圖1I），作者想知道mLECs的自我修復(fù)機(jī)制或其他細(xì)胞間相互作用是否在這一過程中起作用，這值得進(jìn)一步的努力和探索。DEG分析顯示SAH后過度表達(dá)最多的基因（圖6C，D）。S100α6和Cldn5的表達(dá)沿軌跡逐漸升高（圖6E）。既往研究報(bào)道S100A6在乳腺癌中破壞淋巴內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接，增加中性粒細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移，提示S100α6可能是SAH后mLECs損傷的潛在生物標(biāo)志物。

圖6 細(xì)胞軌跡分析顯示了mLECs的進(jìn)化過程

       然后作者對mLVs進(jìn)行免疫熒光染色，以確定S100α6在SAH后的變化。與未損傷組相比，損傷24 h后腦膜S100α6表達(dá)明顯增加，Lyve1+S100α6+陽性細(xì)胞增多，而Lyve1+細(xì)胞減少（圖6I）。相反，敲除THBS1后，S100α6的表達(dá)也顯著降低。此外，通過ELISA檢測，作者證實(shí)S100A6在SAH患者腦脊液樣本中的表達(dá)較對照組增加。預(yù)后分析顯示，S100A6表達(dá)越高，預(yù)后越差（圖6G）。同時(shí)，S100A6和THBS1的表達(dá)呈線性關(guān)系（圖6H），說明兩者都可能是SAH后的合適預(yù)測因子。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)表明S100α6可能是腦膜淋巴損傷的一種新的生物標(biāo)志物，進(jìn)一步補(bǔ)充了mLVs注釋領(lǐng)域的空白。

結(jié)論：

       作者首次闡明了SAH后早期mLVs的空間和細(xì)胞變化。作者發(fā)現(xiàn)隨著周圍免疫微環(huán)境的重塑，mLECs群體發(fā)生了顯著的變化。同時(shí)，THBS1的過表達(dá)和THBS1-CD47的相互作用可能通過STAT3/BCL-2信號通路導(dǎo)致mLECs凋亡。綜上所述，作者的研究結(jié)果可能為后續(xù)的SAH相關(guān)研究和基于受損mLVs改善的SAH干預(yù)治療策略提供新的視角。

實(shí)驗(yàn)方法：

       臨床樣本收集和患者信息、人腦脊液質(zhì)譜分析、ELISA測定、SAH誘導(dǎo)、大池內(nèi)注射、神經(jīng)學(xué)評分和行為測試、神經(jīng)學(xué)評分、掛線測試、dCLNs清除、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、原代腦膜淋巴內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、THP1條件培養(yǎng)基制備、免疫共沉淀、Western Blot分析、單細(xì)胞RNA測序、閱讀比對，質(zhì)量控制和聚類分析，細(xì)胞-細(xì)胞通訊分析，空間轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)處理。

參考文獻(xiàn)：

       Wang X, Zhang A, Yu Q, Wang Z, Wang J, Xu P, Liu Y, Lu J, Zheng J, Li H, Qi Y, Zhang J, Fang Y, Xu S, Zhou J, Wang K, Chen S, Zhang J. Single-Cell RNA Sequencing and Spatial Transcriptomics Reveal Pathogenesis of Meningeal Lymphatic Dysfunction after Experimental Subarachnoid Hemorrhage. Adv Sci (Weinh). 2023 Jul; 10(21):e2301428. doi: 10.1002/advs.202301428. Epub 2023 May 21. PMID: 37211686; PMCID: PMC10375135.