單細胞RNA測序和空間轉錄組學揭示實驗性蛛網膜下腔出血后腦膜淋巴功能障礙的發(fā)病機制

       蛛網膜下腔出血（SAH）是腦卒中中一種致命的亞型，死亡率和致殘率都很高。腦膜淋巴血管（mLVs）是一種新發(fā)現的顱內液體運輸系統(tǒng)，經證實可將腦脊液中滲出的紅細胞引流至頸部深部淋巴結。然而，許多研究報道了mLVs的結構和功能在幾種中樞神經系統(tǒng)疾病中受到損傷。SAH是否可引起mLVs損傷及其機制尚不清楚。本文應用單細胞RNA測序和空間轉錄組學，結合體內/體外實驗，研究SAH后mLVs的細胞、分子和空間模式的改變。首先，研究證明SAH誘導mLVs損傷。然后，通過測序數據的生物信息學分析，發(fā)現血栓反應蛋白1 （THBS1）和S100A6與SAH結局密切相關。此外，THBS1-CD47配體受體對被發(fā)現通過調節(jié)STAT3/Bcl-2信號通路在腦膜淋巴內皮細胞凋亡中起關鍵作用。這些結果首次揭示了SAH后mLVs損傷的情況，并提供了一種基于mLVs通過破壞THBS1和CD47相互作用來保護SAH的潛在治療策略。該文章于2023年5月發(fā)表在《Advanced Science》，IF：15.1。

技術路線：

技術路線圖

主要研究內容：

1. SAH后不同時間進程mLVs變化的單細胞轉錄組圖譜

       為了研究SAH后mLVs是否受損，作者通過向交叉前池注射自體血建立實驗性SAH模型。該模型是探索中樞神經系統(tǒng)淋巴功能的理想模型，因為它不需要完全暴露于頸部解剖結構，可以避免對mLVs的直接影響。此外，在SAH建模后的不同時間，將熒光珠注射到大池內（i.c.m），以進一步評估mLVs的引流功能。結果顯示，早在SAH后3小時，dCLNs的微珠引流就顯著減少，并且引流障礙一直持續(xù)到損傷后72小時（圖1B）。對于dCLNs的上游路徑，在SAH后24和72 h， mLVs中也出現了引流減少和結構損傷（圖1I）。

圖1 SAH后不同時間序列mLVs變化的單細胞轉錄組圖譜

       為了全面闡明SAH后mLVs的細胞組成變化，作者對不同組（Sham組，SAH 24 h組，SAH 72 h組，每組10只小鼠）的小鼠進行了scRNA-seq （10× Genomics）（圖1A）。在原始scRNA-seq數據和相鄰的序列分析中排除受損或死亡細胞和假定的細胞雙鏈后，共保留30只小鼠的25 536個細胞轉錄組，其中9891個細胞來自sham組，8262個細胞來自SAH 24 h組，7383個細胞來自SAH 72 h組（圖1C）。然后，作者根據測序深度和線粒體reads計數對基因表達進行歸一化，并基于細胞間高可變表達基因應用主成分分析（PCA）。為了糾正批次效應，作者將scRNA-seq數據與Seurat整合方法進行整合。在此基礎上，采用統(tǒng)一流形逼近投影（UMAP）嵌入空間和基于圖的聚類方法對細胞簇進行識別。用眾所周知的標記對聚類進行注釋。細胞分為16種主要細胞類型（圖1C-E），包括以Cd79A、Cd79B和Ms4a1為標記的B細胞，以Ncr1、Klrb1c和Nkg7為標記的NKs，以C1qb、Cd68、Csf1r和Mrc1為標記的巨噬細胞，以S100α9、IL1β和Csf3r為標記的中性粒細胞，以Ccr2和Ly6c2為標記的單核細胞，以Cd3d、Cd3e和Cd247為標記的T細胞，以Cd209a和Cd74為標記的pDCs，以Fcer1a、Kit和Ms4a2為標記的肥大細胞，以Ttr、Enpp2和Ptgds為標記的紅細胞，以Car2、Hba-a1、Hbb-bs為標志的紅細胞，以Col1a1、Col1a2、Col3a1、DCN為標志的間充質細胞，以Birc5、Ube2c為標志的上皮細胞，以Pecam1、Cdh5、Kdr為標志的內皮細胞，以Gng13、S100α5為標志的前腦神經元，以S100b、Cdh2為標志的膠質細胞，以Cdh2、Pde6g、Gnb3為標志的神經前體細胞。盡管假手術組和SAH組的mLVs中都出現了所有16種主要細胞類型（圖1C），但每種細胞類型的動態(tài)變化是不同的。同時，鑒于mLECs來源于內皮細胞，作者進一步對內皮細胞進行了聚類分析，得到了三個亞簇。該結果顯示，在SAH后24 h， mLVs比例最?。▓D1F），說明此時mLVs損傷可能是最嚴重的。

       同樣，流式細胞術分析顯示，SAH后CD45-CD31+LYVE1+細胞（mLECs）數量下降，并且在SAH后24 h發(fā)生最嚴重的損傷（圖1H）。此外，在幾項神經功能測試中，與假手術組相比，受傷小鼠的改良Garcia評分較低，Tturn和Ttotal延長，缺陷延長，恢復延遲。綜上所述，這些結果表明，SAH引起小鼠急性期mLVs結構和引流功能的損傷，并引起神經功能的喪失。

2. 空間圖譜的反卷積和細胞類型相互作用的可視化

圖2 SAH后mLVs空間圖譜的反卷積

       如上所述，scRNA-seq數據丟失了每個細胞的空間特征。因此，作者隨后結合ST來提高測序數據的完整性，揭示所有細胞的空間分布。經蘇木精和伊紅（H&E）染色和明場成像，mLVs切片發(fā)現明顯的組織學特征。采用Seurat方法進行標準質量控制和降維，通過t分布隨機嵌入（T-SNE）實現可視化?；诿總€簇中的差異表達基因（DEGs），逐步進行細胞聚類，構建ST圖譜。在最近的一項研究中提到，作者同樣使用RCTD軟件對每個組織覆蓋點進行反卷積，進一步重建了竇解剖的分層和分段結構。預測的12個免疫細胞簇的定位證實了它們在特定區(qū)域（如上矢狀竇[SSS]，橫竇[TS]和熱點）的富集。作者在SSS和TS上繪制了每個點內每個細胞簇的比例作為代表性餅圖（散點餅）。有趣的是，損傷后浸潤到mLVs的免疫細胞發(fā)生了明顯的變化。與正常mLVs相比，浸潤單核細胞在SAH后24小時顯著增加，成為所有細胞簇中的主要細胞群。雖然72 h時浸潤的巨噬細胞最多，以M2亞型為主，但在熱點部位聚集的單核細胞和M1型巨噬細胞明顯增多（圖2A）。

       為了進一步探討腦膜免疫微環(huán)境的改變，作者試圖將每個細胞的scRNA-seq數據映射到ST，以準確揭示SAH后免疫細胞對mLVs的浸潤。免疫細胞浸潤在SAH后24 h以單核細胞為主，72 h以巨噬細胞為主。中性粒細胞浸潤在24 h達到峰值，72 h恢復到正常水平（假手術）。T細胞浸潤在損傷后不同時間進程中逐漸增加，而B細胞浸潤相對穩(wěn)定。損傷后NKs和pDC的浸潤也持續(xù)增加（圖2B）。這些結果反映了隨著SAH的發(fā)展，mLVs在不同階段的細胞變化。

3. 細胞間通訊分析揭示THBS1-CD47配體受體對激活與mLVs損傷相關

       鑒于免疫炎癥一直被認為是SAH發(fā)病的關鍵病理機制，作者的研究結果揭示了sham組和SAH組浸潤免疫細胞的差異，作者想知道免疫微環(huán)境的動態(tài)重塑是否在mLVs損傷中起重要作用。mLECs分布預測的可視化顯示，損傷后24 h mLECs損傷最嚴重（圖3A）。因此，作者首先研究了所有細胞類型之間的細胞間通信，以可視化整體情況。通過多種學習和定量對比，Cell Chat確定了每個細胞簇之間差異過表達的配體和受體?？偣矙z測到4239對顯著的L-R對，進一步將其分類為2258條信號通路。通過統(tǒng)計檢驗，隨機排列細胞的組標簽，然后重新計算相互作用概率，確定顯著的相互作用。

       接下來，作者開始尋找mLECs和其他細胞類型之間的關系。確定了幾個對mLECs的輸出或輸入信號模式貢獻最大的信號（圖3B）。綜上所述，損傷后24 h時mLVs損傷最為嚴重，單核細胞在這段時間內以浸潤細胞為主，說明單核細胞與mLVs的相互作用可能在mLVs功能障礙中起關鍵作用。因此，通過關注mLECs和單核細胞之間的通信，作者發(fā)現THBS信號通路特別積極地參與所有信號模式。作者進一步探索了基于THBS信號作用于mLECs的潛在L-R對，并計算了這些L-R對的貢獻。其中，L-R對“THBS1-CD47”在細胞間通訊中表現出最強的相互作用（圖3C）。為了進一步評估THBS1-CD47 L-R對的空間分布，作者使用了專門用于分析空間通信的技術stLearn，該技術可以將細胞的空間信息與所有預測的通信結合起來，發(fā)現L-R對的區(qū)域特異性。結合鄰近點之間的L-R共表達富集和細胞類型密度富集，發(fā)現組織內的熱點，細胞類型之間的相互作用最有可能發(fā)生。結果顯示，THBS1-CD47 L-R對在SAH后24小時顯著激活（圖3D）。

圖3 mLVs內部和周圍的細胞間通信網絡

4. THBS1損害腦膜淋巴引流，加重神經功能障礙

       在發(fā)現THBS1-CD47 L-R對可能與mLVs損傷相關后，作者想要評估SAH后THBS1的影響。作者使用Proteome Xchange Consortium （PXD030593）的質譜蛋白質組學數據檢測SAH后內源性THBS1的改變。質譜測定的SAH患者腦脊液中差異表達蛋白顯示THBS1蛋白顯著上調（作者以正常壓力腦積水（NPH）患者腦脊液樣本作為對照組，圖3E）。鑒于人類THBS家族有THBS1、THBS2和THBS4三種亞型，作者使用ELISA試劑盒再次檢測了SAH患者腦脊液樣本中所有THBS亞型的表達，以驗證THBS1是否是THBS的關鍵成員。正如作者所料，盡管THBS2和THBS4水平也升高，但與NPH組相比，SAH后THBS1的表達增加最多（圖3F）。此外，較高的THBS1水平與SAH患者較差的臨床預后密切相關（圖6F）。

圖4驗證THBS1對SAH后mLVs功能的影響

       然后，作者進行了體內實驗，探討THBS1在SAH后mLVs損傷中的作用。首先，將低劑量小鼠重組THBS1蛋白注入小鼠大池，觀察mLVs功能的變化。與陰性對照（NC）小鼠相比，重組THBS1 （rTHBS1）蛋白處理導致mLVs和dCLNs中的小珠聚集減少（圖3G，I），mLVs的mLECs數量減少（圖3H）。其次，作者通過將AAV-THBS1注入小鼠大池構建THBS1過表達小鼠，并培養(yǎng)THBS1-KO小鼠進行進一步研究。與AAV對照相比，SAH后使用AAV-THBS1治療的mLVs損傷更嚴重（圖4A-C）。相反，THBS1-KO部分逆轉了SAH引起的mLVs損傷（圖4H-J）。此外，神經功能測試也給出了類似的結果。THBS1過表達加重了SAH引起的神經功能缺損，而敲除THBS1可改善神經功能（圖4D-G， K-N）。更重要的是，與THBS1敲除的結果一致，用THBS1抗體阻斷THBS1后，mLVs和神經功能損傷也得到逆轉（圖5A-G）。綜上所述，這些結果證明THBS1上調導致SAH后mLVs結構和引流功能受損，從而加重神經行為功能障礙。

5. 干擾THBS1-CD47相互作用通過抑制STAT3/ BCL2介導的mLECs細胞凋亡促進mLVs修復

       既往研究報道THBS1通過與其受體CD47結合抑制內皮細胞增殖和趨化作用。同樣，作者的研究結果預測了THBS1-CD47 L-R對在mLVs損傷中發(fā)揮重要作用，并證明了THBS1在SAH后的損傷作用。因此，作者繼續(xù)研究CD47的功能。與igG處理相比，在SAH后24小時用抗體阻斷CD47可減輕腦膜淋巴功能障礙（圖5A-C）。相應的，神經功能也明顯改善（圖5D-G）。

       接下來，為了進一步研究THBS1-CD47相互作用誘導損傷的潛在機制，作者進行了GSEA分析。結果顯示，損傷24 h后mLECs細胞凋亡通路明顯激活（圖5H）。Tunel染色顯示SAH后細胞凋亡明顯激活。THBS1過表達進一步促進了mLVs的凋亡，而THBS1阻斷導致Lyve1+Tunel+細胞減少。人單核細胞與LECs體外共培養(yǎng)證實，在血紅蛋白（150μm）刺激下，共培養(yǎng)體系上清中THBS1含量顯著增加，說明單核細胞是SAH后THBS1分泌的來源之一。流式細胞術分析顯示，與對照組相比，經THBS1中和抗體預處理的共培養(yǎng)體系中LECs的凋亡明顯減少。然而，mLVs損傷的確切機制尚不清楚。

       研究表明THBS1-CD47相互作用通過干擾內皮細胞發(fā)育所必需的VEGF/VEGFR2信號誘導內皮細胞凋亡。此外，VEGFR2抑制通過抑制骨肉瘤STAT3/BCL-2信號通路促進骨肉瘤細胞凋亡。因此，作者假設THBS1-CD47相互作用是否可以通過抑制STAT3/BCL-2信號傳導來治療mLECs凋亡。首先，共免疫沉淀（COIP）證實了LECs中THBS1和CD47之間的相互作用。其次，在原發(fā)性mLECs中，rTHBS1處理后，隨著Bax的表達增加，pSTAT3和BCL-2的表達呈劑量依賴性顯著降低（圖5I），表明rTHBS1處理通過抑制STAT3/BCL-2信號通路的激活促進mLECs凋亡。最后，在SAH小鼠mLVs樣本中，pSTAT3和BCL-2水平在SAH后24 h達到峰值，然后在72 h下降，這與GSEA結果一致（圖5J）。THBS1敲除或阻斷THBS1/CD47均可顯著增加pSTAT3和BCL-2的表達（圖5K，M），而THBS1過表達則相反（圖5L）。綜上所述，這些研究結果證實THBS1-CD47 L-R對通過STAT3/BCL-2信號通路促進mLVs凋亡，抑制這種相互作用可能有助于減輕mLVs損傷。

圖5干擾THBS1-CD47相互作用通過抑制STAT3/ BCL2介導的mLECs細胞凋亡促進mLVs恢復

6. 擬時序分析顯示SAH后mLECs的改變痕跡

       此外，作者對不同樣本中的所有mLECs進行了擬時序分析，以揭示SAH后EBI階段mLECs的變化軌跡（圖6A）。用真實分組信息標記mLECs后，作者發(fā)現SAH后24 h mLECs的損傷模式與上述發(fā)現一致。然而，出乎意料的是，與假手術組和24小時組相比，72h的mLECs似乎具有完全不同的細胞狀態(tài)或特征（圖6B）。考慮到mLECs損傷在SAH后72 h得到部分改善（圖1I），作者想知道mLECs的自我修復機制或其他細胞間相互作用是否在這一過程中起作用，這值得進一步的努力和探索。DEG分析顯示SAH后過度表達最多的基因（圖6C，D）。S100α6和Cldn5的表達沿軌跡逐漸升高（圖6E）。既往研究報道S100A6在乳腺癌中破壞淋巴內皮細胞緊密連接，增加中性粒細胞的跨內皮遷移，提示S100α6可能是SAH后mLECs損傷的潛在生物標志物。

圖6 細胞軌跡分析顯示了mLECs的進化過程

       然后作者對mLVs進行免疫熒光染色，以確定S100α6在SAH后的變化。與未損傷組相比，損傷24 h后腦膜S100α6表達明顯增加，Lyve1+S100α6+陽性細胞增多，而Lyve1+細胞減少（圖6I）。相反，敲除THBS1后，S100α6的表達也顯著降低。此外，通過ELISA檢測，作者證實S100A6在SAH患者腦脊液樣本中的表達較對照組增加。預后分析顯示，S100A6表達越高，預后越差（圖6G）。同時，S100A6和THBS1的表達呈線性關系（圖6H），說明兩者都可能是SAH后的合適預測因子。綜上所述，作者的數據表明S100α6可能是腦膜淋巴損傷的一種新的生物標志物，進一步補充了mLVs注釋領域的空白。

結論：

       作者首次闡明了SAH后早期mLVs的空間和細胞變化。作者發(fā)現隨著周圍免疫微環(huán)境的重塑，mLECs群體發(fā)生了顯著的變化。同時，THBS1的過表達和THBS1-CD47的相互作用可能通過STAT3/BCL-2信號通路導致mLECs凋亡。綜上所述，作者的研究結果可能為后續(xù)的SAH相關研究和基于受損mLVs改善的SAH干預治療策略提供新的視角。

實驗方法：

       臨床樣本收集和患者信息、人腦脊液質譜分析、ELISA測定、SAH誘導、大池內注射、神經學評分和行為測試、神經學評分、掛線測試、dCLNs清除、免疫熒光、流式細胞術、原代腦膜淋巴內皮細胞培養(yǎng)、THP1條件培養(yǎng)基制備、免疫共沉淀、Western Blot分析、單細胞RNA測序、閱讀比對，質量控制和聚類分析，細胞-細胞通訊分析，空間轉錄組測序和數據處理。

參考文獻：

       Wang X, Zhang A, Yu Q, Wang Z, Wang J, Xu P, Liu Y, Lu J, Zheng J, Li H, Qi Y, Zhang J, Fang Y, Xu S, Zhou J, Wang K, Chen S, Zhang J. Single-Cell RNA Sequencing and Spatial Transcriptomics Reveal Pathogenesis of Meningeal Lymphatic Dysfunction after Experimental Subarachnoid Hemorrhage. Adv Sci (Weinh). 2023 Jul; 10(21):e2301428. doi: 10.1002/advs.202301428. Epub 2023 May 21. PMID: 37211686; PMCID: PMC10375135.