IgSF11的缺乏通過抑制早期軟骨下骨的改變來減輕小鼠骨關節(jié)炎

       骨關節(jié)炎（OA）是一種退行性關節(jié)疾病。雖然它的典型特征是關節(jié)軟骨破壞，但它影響到關節(jié)的所有組織，因此也伴隨著局部炎癥、軟骨下骨改變和持續(xù)性疼痛。然而，作者對骨性關節(jié)炎進展過程中潛在的軟骨下骨動力學的了解很貧乏。在這里，作者通過一個小鼠模型展示了免疫球蛋白超家族11（IgSF11）在骨性關節(jié)炎軟骨下骨重建中的作用。特別是，在內側半月板（DMM）誘導的OA不穩(wěn)定后，IgSF11迅速通過分化的破骨細胞表達，并在軟骨下骨中上調。在小鼠中，IgSF11缺乏不僅可以抑制OA軟骨下骨的變化，還能阻止軟骨破壞。OA軟骨下骨中表達IgSF11的細胞被發(fā)現(xiàn)參與破骨細胞成熟和骨吸收，并與關鍵破骨細胞分化因子核因子κ-B（RANK）受體激活劑共定位。因此，作者的研究表明，阻斷OA的早期軟骨下骨變化可以改善OA的關節(jié)軟骨破壞。本文于2023年12月發(fā)表于期刊《Experimental & Molecular Medicine》，IF=12.8

主要技術路線：

主要研究成果：

1、IgSF11在小鼠OA的軟骨下骨（SB）中快速表達

       由于最近的研究表明IgSF11是破骨細胞成熟所必需的，因此作者首先證實破骨細胞生成誘導的核因子κ-B （RANK）配體受體激活劑（RANKL）刺激增加了骨髓來源的巨噬細胞（BMM）中IgSF11的表達。事實上，IgSF11蛋白表達上升，并在第1天達到峰值（圖1a）。然后，作者檢查了DMM手術誘導OA后1或2周小鼠的SB中是否表達了IgSF11。DMM是一種廣泛使用的動物模型，用于研究OA中的軟骨退化和SB動力學。WT小鼠SB的qRT-PCR顯示，SB中IgSF11 mRNA表達在1周時上升，然后在2周時下降（圖1b）。因此，在OA誘導后，IgSF11在SB中迅速上調。

       值得注意的是，軟骨細胞不表達IgSF11；對接受和未接受DMM手術誘導的OA的WT小鼠的關節(jié)組織進行免疫熒光分析表明，如果IgSF11表達，它總是在SB而不是軟骨中（圖1c、d）。當作者對接受全膝關節(jié)置換手術的OA患者受損和未受損的軟骨進行免疫組織化學分析時，也觀察到了這種現(xiàn)象。因此，OA中IgSF11的表達僅限于SB。

圖1 IgSF11表達在體外迅速上調，可分化破骨細胞和骨關節(jié)炎軟骨下骨

2、遺傳性IgSF11缺失減輕骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨退變

       為探討IgSF11在骨性關節(jié)炎發(fā)病機制中的作用，作者采用骨髓瘤手術誘導WT和IgSF11缺失（IgSF11?/?）小鼠骨性關節(jié)炎。為觀察關節(jié)軟骨和軟骨下骨的逐漸變化，分別于1、2、4、8周處死小鼠，取關節(jié)。OARSI分級顯示，在2周、4周和8周時，IgSF11?/?小鼠的關節(jié)軟骨破壞程度明顯低于WT小鼠，但在1周時則不然（圖2a，b）。因此，在骨性關節(jié)炎的軟骨破壞中需要IgSF11。

圖2 IgSF11?/?小鼠在骨性關節(jié)炎誘導后軟骨破壞減輕

3、IgSF11?/?小鼠在骨性關節(jié)炎誘導后不久的SB中顯示較少的破骨細胞活性

       破骨細胞是SB重塑的關鍵調節(jié)細胞。它們還與關節(jié)中的許多細胞相互作用，包括成骨細胞、軟骨細胞和免疫細胞。特別是，人們認為雖然成骨細胞在OA中誘導SB硬化，但該過程實際上是由破骨細胞啟動的。由于作者發(fā)現(xiàn)（1）IgSF11在OA誘導后不久在SB中上調，（2）分化的破骨細胞在體外表達IgSF11，以及（3）IgSF11?/?小鼠在整個OA過程中表現(xiàn)出較低的關節(jié)軟骨退化，作者推測SB中表達IgSF11的破骨細胞促進OA中的關節(jié)軟骨破壞，并且這種作用很早就開始了。

       為了檢驗這一假設，作者研究了IgSF11缺失對OA期間破骨細胞和成骨細胞活性的影響。事實上，破骨細胞標記物TRAP的染色顯示，與WT小鼠相比，IgSF11?/?小鼠在DMM手術后1周表現(xiàn)出顯著較低的破骨細胞活化（圖3a、b）。此外，與WT小鼠相比，IgSF11?/?小鼠從2周開始就有較少的成骨細胞（圖3c）。這一發(fā)現(xiàn)支持這樣的觀點，即表達IgSF11的破骨細胞在OA誘導后不久就會誘導骨吸收，并且該過程隨后激活成骨細胞，然后形成過多的骨。

圖3 IgSF11?/?小鼠在骨性關節(jié)炎誘導后不久即表現(xiàn)出破骨細胞活性降低

4、IgSF11基因敲除可減少小鼠骨性關節(jié)炎中SB的變化

       圖2a所示的組織學分析表明，雖然IgSF11缺失與OA后期SB板（SBP）增厚減少有關，但IgSF11?/?小鼠的SBP在第一周似乎更厚。為了在定量水平上證實這些發(fā)現(xiàn)，作者用組織學評分系統(tǒng)測量了骨性關節(jié)炎患者的SBP厚度。作者還測量了另外兩個關鍵變量，即骨體積（BV/TV）和骨贅成熟度。事實上，IgSF11?/?小鼠在1周時表現(xiàn)出更大的SBP增厚，盡管這種變化沒有統(tǒng)計學意義。然而，從2周開始，基因敲除的小鼠的SBP明顯變?。▓D4A）。在骨體積和骨贅成熟方面也觀察到了類似的差異（圖4b，c）。這些差異可能是由于IgSF11?/?小鼠的破骨細胞活性較低所致：這一現(xiàn)象導致了破骨細胞：成骨細胞失衡，最初導致SBP中更多的骨形成而不是骨吸收。然而，后來，腔隙的缺乏意味著成骨細胞沒有被激活，也不會導致SBP增厚。

       小鼠OA中SB結構的變化與破骨細胞釋放活性TGF-β相關，從而誘導間充質干細胞中的Smad2/3磷酸化。這個過程導致它們增殖并分化為osterix+骨祖細胞，從而加速異常骨形成和血管生成。為了確定IgSF11敲除是否會干擾這一過程，作者使用抗pSmad3和抗osterix進行了免疫組織化學分析。事實上，在IgSF11?/?小鼠的SB中，這兩種標志物在第1周和第2周時均下降（圖5a-c）。因此，IgSF11敲除減弱了小鼠OA的早期SB變化。

       作者通過另一種OA動物模型（即自發(fā)性年齡誘導的OA）證實了IgSF11在OA軟骨破壞中的重要性。當作者檢查6個月和12個月大的WT和IgSF11?/?小鼠的關節(jié)軟骨和SB時，作者發(fā)現(xiàn)IgSF11缺失與12（但不是6）個月齡的關節(jié)軟骨破壞顯著減少相關。IgSF11基因敲除也與6個月時SBP增厚和骨體積增加有關，但在12個月時SBP變薄和骨體積變小。此外，作者觀察到，隨著WT小鼠在6個月齡時開始發(fā)展為骨性關節(jié)炎，它們在SB中的IgSF11表達上升。在12個月齡建立骨性關節(jié)炎時，這種表達已經(jīng)正?；?。這些發(fā)現(xiàn)都與作者對DMM手術誘導的骨性關節(jié)炎的觀察結果相似（圖2和圖4），表明IgSF11不僅在創(chuàng)傷后骨性關節(jié)炎中指示SB重建和關節(jié)軟骨破壞，而且在年齡相關的骨性關節(jié)炎中也是如此。

圖4 IgSF11?/?小鼠在OA后期表現(xiàn)出較少的軟骨下骨增厚

圖5 IgSF11?/?小鼠在骨關節(jié)炎軟骨下骨中表現(xiàn)出TGF-β信號減弱

5、破骨細胞中IgSF11敲除可減少OA中軟骨細胞的分解代謝

       SB和軟骨之間的動態(tài)細胞和分子相互作用在關節(jié)穩(wěn)態(tài)和OA發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。特別是，OA中破骨細胞的異常形成和由此產(chǎn)生的SB重塑與軟骨基質中軟骨細胞分解代謝的增加和合成代謝的減少密切相關。潛在機制至少部分涉及破骨細胞釋放生物活性分子。因此，為了測試IgSF11是否可以介導破骨細胞塑造軟骨細胞分解代謝/合成代謝的能力，作者從na?ve WT和IgSF11?/?小鼠中分離破骨細胞祖細胞，誘導它們分化為破骨細胞，收獲它們的條件培養(yǎng)基（OC-CM），然后用OC-CM培養(yǎng)WT原代關節(jié)軟骨細胞。正如預期的那樣，WT CM顯著上調軟骨細胞中基質降解酶Mmp3和Mmp13的mRNA表達。相反，來自IgSF11?/?破骨細胞的OC-CM對軟骨細胞分解代謝的促進作用比WT OC-CM弱（圖6）。因此，IgSF11敲除不僅損害了破骨細胞吸收骨的能力，而且還削弱了它們釋放增加軟骨細胞分解代謝的分子。

       為了在體內測試這一發(fā)現(xiàn)，作者使用針對MMP3、MMP13、COL2A1和聚集蛋白聚糖的抗體對患有DMM手術誘導OA的WT和IgSF11?/?小鼠的軟骨進行免疫組織化學分析。事實上，隨著疾病的進展，WT小鼠的軟骨細胞越來越多地表達MMP3和MMP13，而當IgSF11被敲除時，這種效應在很大程度上被阻斷。相反，隨著疾病的進展，WT軟骨細胞表達的COL2A1和聚集蛋白聚糖水平降低，并且這種現(xiàn)象在IgSF11?/?小鼠中得到了很大程度的改善。因此，WT破骨細胞可能會產(chǎn)生刺激軟骨細胞分解代謝的分子，而這個過程依賴于IgSF11。這些發(fā)現(xiàn)共同支持了以下觀點：IgSF11促進（1）破骨細胞吸收和SB重塑，以及（2）破骨細胞介導的軟骨細胞調節(jié)及其對OA軟骨的破壞。

圖6 IgSF11缺失會阻斷破骨細胞分泌體增強體外軟骨細胞分解代謝的能力

6、SB中表達IgSF11的細胞與RANK共定位

       為了確定表達IgSF11的細胞在DMM手術誘導的骨性關節(jié)炎WT小鼠SB中的確切位置和形態(tài)，作者用IgSF11和破骨細胞分化和功能的經(jīng)典標志物進行了雙重免疫熒光染色。這些標記物是RANK，它是破骨細胞分化所必需的關鍵破骨細胞受體；識別M-CSF并促進破骨細胞分化成熟的CSF-1R；TRAP，破骨細胞在骨吸收過程中分泌的；CTSK，是骨吸收過程中破骨細胞釋放的一種關鍵的I型膠原蛋白酶；Atp6v0d2，它是破骨細胞特異性質子泵的重要組成部分，在骨吸收過程中介導細胞外酸化。WT小鼠在骨關節(jié)炎誘導后1周，RANK與表達IgSF11的細胞共存。這些細胞主要位于骨髓中，呈圓形，有一個或兩個核（圖7a，b）。然而，CSF-1R、TRAP、CTSK和Atp6v0d2大部分位于SB表面，并不與表達IgSF11的細胞共定位。值得注意的是，qRT-PCR顯示IgSF11敲除顯著降低了早期OA SB中的RANK mRNA表達（圖7c）。SB中RANK+IgSF11+細胞的骨髓位置及其形態(tài)表明表達IgSF11的細胞不是成熟的破骨細胞。盡管如此，考慮到表達IgSF11的細胞也表達RANK，很明顯IgSF11參與OA中的破骨細胞成熟和骨吸收。

圖7 患有OA的WT小鼠軟骨下骨中表達IgSF11的細胞與RANK共定位

       作者的研究表明阻斷OA的早期軟骨下骨變化可以改善OA的關節(jié)軟骨破壞。此外，在DMM誘導的OA不穩(wěn)定后，IgSF11迅速通過分化的破骨細胞表達，并在軟骨下骨中上調。IgSF11缺乏不僅可以抑制OA軟骨下骨的變化，還能阻止軟骨破壞。OA軟骨下骨中表達IgSF11的細胞被發(fā)現(xiàn)參與破骨細胞成熟和骨吸收，并與關鍵破骨細胞分化因子核因子κ-B（RANK）受體激活劑共定位。作者的發(fā)現(xiàn)為OA的治療提供了新的策略。

實驗方法：

       WB、組織學和免疫組織化學、免疫熒光染色、qRT?PCR

參考文獻：

       Kim GM, Kim J, Lee J-Y, Park M-C, Lee SY. IgSF11 deficiency alleviates osteoarthritis in mice by suppressing early subchondral bone changes. Experimental & Molecular Medicine. 2023. doi: 10.1038/s12276-023-01126-6.