IgSF11的缺乏通過(guò)抑制早期軟骨下骨的改變來(lái)減輕小鼠骨關(guān)節(jié)炎

       骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種退行性關(guān)節(jié)疾病。雖然它的典型特征是關(guān)節(jié)軟骨破壞，但它影響到關(guān)節(jié)的所有組織，因此也伴隨著局部炎癥、軟骨下骨改變和持續(xù)性疼痛。然而，作者對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展過(guò)程中潛在的軟骨下骨動(dòng)力學(xué)的了解很貧乏。在這里，作者通過(guò)一個(gè)小鼠模型展示了免疫球蛋白超家族11（IgSF11）在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨重建中的作用。特別是，在內(nèi)側(cè)半月板（DMM）誘導(dǎo)的OA不穩(wěn)定后，IgSF11迅速通過(guò)分化的破骨細(xì)胞表達(dá)，并在軟骨下骨中上調(diào)。在小鼠中，IgSF11缺乏不僅可以抑制OA軟骨下骨的變化，還能阻止軟骨破壞。OA軟骨下骨中表達(dá)IgSF11的細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)參與破骨細(xì)胞成熟和骨吸收，并與關(guān)鍵破骨細(xì)胞分化因子核因子κ-B（RANK）受體激活劑共定位。因此，作者的研究表明，阻斷OA的早期軟骨下骨變化可以改善OA的關(guān)節(jié)軟骨破壞。本文于2023年12月發(fā)表于期刊《Experimental & Molecular Medicine》，IF=12.8

主要技術(shù)路線：

主要研究成果：

1、IgSF11在小鼠OA的軟骨下骨（SB）中快速表達(dá)

       由于最近的研究表明IgSF11是破骨細(xì)胞成熟所必需的，因此作者首先證實(shí)破骨細(xì)胞生成誘導(dǎo)的核因子κ-B （RANK）配體受體激活劑（RANKL）刺激增加了骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（BMM）中IgSF11的表達(dá)。事實(shí)上，IgSF11蛋白表達(dá)上升，并在第1天達(dá)到峰值（圖1a）。然后，作者檢查了DMM手術(shù)誘導(dǎo)OA后1或2周小鼠的SB中是否表達(dá)了IgSF11。DMM是一種廣泛使用的動(dòng)物模型，用于研究OA中的軟骨退化和SB動(dòng)力學(xué)。WT小鼠SB的qRT-PCR顯示，SB中IgSF11 mRNA表達(dá)在1周時(shí)上升，然后在2周時(shí)下降（圖1b）。因此，在OA誘導(dǎo)后，IgSF11在SB中迅速上調(diào)。

       值得注意的是，軟骨細(xì)胞不表達(dá)IgSF11；對(duì)接受和未接受DMM手術(shù)誘導(dǎo)的OA的WT小鼠的關(guān)節(jié)組織進(jìn)行免疫熒光分析表明，如果IgSF11表達(dá)，它總是在SB而不是軟骨中（圖1c、d）。當(dāng)作者對(duì)接受全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的OA患者受損和未受損的軟骨進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析時(shí)，也觀察到了這種現(xiàn)象。因此，OA中IgSF11的表達(dá)僅限于SB。

圖1 IgSF11表達(dá)在體外迅速上調(diào)，可分化破骨細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨

2、遺傳性IgSF11缺失減輕骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變

       為探討IgSF11在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用，作者采用骨髓瘤手術(shù)誘導(dǎo)WT和IgSF11缺失（IgSF11?/?）小鼠骨性關(guān)節(jié)炎。為觀察關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的逐漸變化，分別于1、2、4、8周處死小鼠，取關(guān)節(jié)。OARSI分級(jí)顯示，在2周、4周和8周時(shí)，IgSF11?/?小鼠的關(guān)節(jié)軟骨破壞程度明顯低于WT小鼠，但在1周時(shí)則不然（圖2a，b）。因此，在骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞中需要IgSF11。

圖2 IgSF11?/?小鼠在骨性關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)后軟骨破壞減輕

3、IgSF11?/?小鼠在骨性關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)后不久的SB中顯示較少的破骨細(xì)胞活性

       破骨細(xì)胞是SB重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細(xì)胞。它們還與關(guān)節(jié)中的許多細(xì)胞相互作用，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和免疫細(xì)胞。特別是，人們認(rèn)為雖然成骨細(xì)胞在OA中誘導(dǎo)SB硬化，但該過(guò)程實(shí)際上是由破骨細(xì)胞啟動(dòng)的。由于作者發(fā)現(xiàn)（1）IgSF11在OA誘導(dǎo)后不久在SB中上調(diào)，（2）分化的破骨細(xì)胞在體外表達(dá)IgSF11，以及（3）IgSF11?/?小鼠在整個(gè)OA過(guò)程中表現(xiàn)出較低的關(guān)節(jié)軟骨退化，作者推測(cè)SB中表達(dá)IgSF11的破骨細(xì)胞促進(jìn)OA中的關(guān)節(jié)軟骨破壞，并且這種作用很早就開始了。

       為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，作者研究了IgSF11缺失對(duì)OA期間破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性的影響。事實(shí)上，破骨細(xì)胞標(biāo)記物TRAP的染色顯示，與WT小鼠相比，IgSF11?/?小鼠在DMM手術(shù)后1周表現(xiàn)出顯著較低的破骨細(xì)胞活化（圖3a、b）。此外，與WT小鼠相比，IgSF11?/?小鼠從2周開始就有較少的成骨細(xì)胞（圖3c）。這一發(fā)現(xiàn)支持這樣的觀點(diǎn)，即表達(dá)IgSF11的破骨細(xì)胞在OA誘導(dǎo)后不久就會(huì)誘導(dǎo)骨吸收，并且該過(guò)程隨后激活成骨細(xì)胞，然后形成過(guò)多的骨。

圖3 IgSF11?/?小鼠在骨性關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)后不久即表現(xiàn)出破骨細(xì)胞活性降低

4、IgSF11基因敲除可減少小鼠骨性關(guān)節(jié)炎中SB的變化

       圖2a所示的組織學(xué)分析表明，雖然IgSF11缺失與OA后期SB板（SBP）增厚減少有關(guān)，但IgSF11?/?小鼠的SBP在第一周似乎更厚。為了在定量水平上證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，作者用組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)測(cè)量了骨性關(guān)節(jié)炎患者的SBP厚度。作者還測(cè)量了另外兩個(gè)關(guān)鍵變量，即骨體積（BV/TV）和骨贅成熟度。事實(shí)上，IgSF11?/?小鼠在1周時(shí)表現(xiàn)出更大的SBP增厚，盡管這種變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，從2周開始，基因敲除的小鼠的SBP明顯變?。▓D4A）。在骨體積和骨贅成熟方面也觀察到了類似的差異（圖4b，c）。這些差異可能是由于IgSF11?/?小鼠的破骨細(xì)胞活性較低所致：這一現(xiàn)象導(dǎo)致了破骨細(xì)胞：成骨細(xì)胞失衡，最初導(dǎo)致SBP中更多的骨形成而不是骨吸收。然而，后來(lái)，腔隙的缺乏意味著成骨細(xì)胞沒有被激活，也不會(huì)導(dǎo)致SBP增厚。

       小鼠OA中SB結(jié)構(gòu)的變化與破骨細(xì)胞釋放活性TGF-β相關(guān)，從而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞中的Smad2/3磷酸化。這個(gè)過(guò)程導(dǎo)致它們?cè)鲋巢⒎只癁?span>osterix+骨祖細(xì)胞，從而加速異常骨形成和血管生成。為了確定IgSF11敲除是否會(huì)干擾這一過(guò)程，作者使用抗pSmad3和抗osterix進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。事實(shí)上，在IgSF11?/?小鼠的SB中，這兩種標(biāo)志物在第1周和第2周時(shí)均下降（圖5a-c）。因此，IgSF11敲除減弱了小鼠OA的早期SB變化。

       作者通過(guò)另一種OA動(dòng)物模型（即自發(fā)性年齡誘導(dǎo)的OA）證實(shí)了IgSF11在OA軟骨破壞中的重要性。當(dāng)作者檢查6個(gè)月和12個(gè)月大的WT和IgSF11?/?小鼠的關(guān)節(jié)軟骨和SB時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)IgSF11缺失與12（但不是6）個(gè)月齡的關(guān)節(jié)軟骨破壞顯著減少相關(guān)。IgSF11基因敲除也與6個(gè)月時(shí)SBP增厚和骨體積增加有關(guān)，但在12個(gè)月時(shí)SBP變薄和骨體積變小。此外，作者觀察到，隨著WT小鼠在6個(gè)月齡時(shí)開始發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎，它們?cè)?span>SB中的IgSF11表達(dá)上升。在12個(gè)月齡建立骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)，這種表達(dá)已經(jīng)正常化。這些發(fā)現(xiàn)都與作者對(duì)DMM手術(shù)誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎的觀察結(jié)果相似（圖2和圖4），表明IgSF11不僅在創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎中指示SB重建和關(guān)節(jié)軟骨破壞，而且在年齡相關(guān)的骨性關(guān)節(jié)炎中也是如此。

圖4 IgSF11?/?小鼠在OA后期表現(xiàn)出較少的軟骨下骨增厚

圖5 IgSF11?/?小鼠在骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨中表現(xiàn)出TGF-β信號(hào)減弱

5、破骨細(xì)胞中IgSF11敲除可減少OA中軟骨細(xì)胞的分解代謝

       SB和軟骨之間的動(dòng)態(tài)細(xì)胞和分子相互作用在關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)和OA發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。特別是，OA中破骨細(xì)胞的異常形成和由此產(chǎn)生的SB重塑與軟骨基質(zhì)中軟骨細(xì)胞分解代謝的增加和合成代謝的減少密切相關(guān)。潛在機(jī)制至少部分涉及破骨細(xì)胞釋放生物活性分子。因此，為了測(cè)試IgSF11是否可以介導(dǎo)破骨細(xì)胞塑造軟骨細(xì)胞分解代謝/合成代謝的能力，作者從na?ve WT和IgSF11?/?小鼠中分離破骨細(xì)胞祖細(xì)胞，誘導(dǎo)它們分化為破骨細(xì)胞，收獲它們的條件培養(yǎng)基（OC-CM），然后用OC-CM培養(yǎng)WT原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。正如預(yù)期的那樣，WT CM顯著上調(diào)軟骨細(xì)胞中基質(zhì)降解酶Mmp3和Mmp13的mRNA表達(dá)。相反，來(lái)自IgSF11?/?破骨細(xì)胞的OC-CM對(duì)軟骨細(xì)胞分解代謝的促進(jìn)作用比WT OC-CM弱（圖6）。因此，IgSF11敲除不僅損害了破骨細(xì)胞吸收骨的能力，而且還削弱了它們釋放增加軟骨細(xì)胞分解代謝的分子。

       為了在體內(nèi)測(cè)試這一發(fā)現(xiàn)，作者使用針對(duì)MMP3、MMP13、COL2A1和聚集蛋白聚糖的抗體對(duì)患有DMM手術(shù)誘導(dǎo)OA的WT和IgSF11?/?小鼠的軟骨進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。事實(shí)上，隨著疾病的進(jìn)展，WT小鼠的軟骨細(xì)胞越來(lái)越多地表達(dá)MMP3和MMP13，而當(dāng)IgSF11被敲除時(shí)，這種效應(yīng)在很大程度上被阻斷。相反，隨著疾病的進(jìn)展，WT軟骨細(xì)胞表達(dá)的COL2A1和聚集蛋白聚糖水平降低，并且這種現(xiàn)象在IgSF11?/?小鼠中得到了很大程度的改善。因此，WT破骨細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生刺激軟骨細(xì)胞分解代謝的分子，而這個(gè)過(guò)程依賴于IgSF11。這些發(fā)現(xiàn)共同支持了以下觀點(diǎn)：IgSF11促進(jìn)（1）破骨細(xì)胞吸收和SB重塑，以及（2）破骨細(xì)胞介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)及其對(duì)OA軟骨的破壞。

圖6 IgSF11缺失會(huì)阻斷破骨細(xì)胞分泌體增強(qiáng)體外軟骨細(xì)胞分解代謝的能力

6、SB中表達(dá)IgSF11的細(xì)胞與RANK共定位

       為了確定表達(dá)IgSF11的細(xì)胞在DMM手術(shù)誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎WT小鼠SB中的確切位置和形態(tài)，作者用IgSF11和破骨細(xì)胞分化和功能的經(jīng)典標(biāo)志物進(jìn)行了雙重免疫熒光染色。這些標(biāo)記物是RANK，它是破骨細(xì)胞分化所必需的關(guān)鍵破骨細(xì)胞受體；識(shí)別M-CSF并促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟的CSF-1R；TRAP，破骨細(xì)胞在骨吸收過(guò)程中分泌的；CTSK，是骨吸收過(guò)程中破骨細(xì)胞釋放的一種關(guān)鍵的I型膠原蛋白酶；Atp6v0d2，它是破骨細(xì)胞特異性質(zhì)子泵的重要組成部分，在骨吸收過(guò)程中介導(dǎo)細(xì)胞外酸化。WT小鼠在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)后1周，RANK與表達(dá)IgSF11的細(xì)胞共存。這些細(xì)胞主要位于骨髓中，呈圓形，有一個(gè)或兩個(gè)核（圖7a，b）。然而，CSF-1R、TRAP、CTSK和Atp6v0d2大部分位于SB表面，并不與表達(dá)IgSF11的細(xì)胞共定位。值得注意的是，qRT-PCR顯示IgSF11敲除顯著降低了早期OA SB中的RANK mRNA表達(dá)（圖7c）。SB中RANK+IgSF11+細(xì)胞的骨髓位置及其形態(tài)表明表達(dá)IgSF11的細(xì)胞不是成熟的破骨細(xì)胞。盡管如此，考慮到表達(dá)IgSF11的細(xì)胞也表達(dá)RANK，很明顯IgSF11參與OA中的破骨細(xì)胞成熟和骨吸收。

圖7 患有OA的WT小鼠軟骨下骨中表達(dá)IgSF11的細(xì)胞與RANK共定位

       作者的研究表明阻斷OA的早期軟骨下骨變化可以改善OA的關(guān)節(jié)軟骨破壞。此外，在DMM誘導(dǎo)的OA不穩(wěn)定后，IgSF11迅速通過(guò)分化的破骨細(xì)胞表達(dá)，并在軟骨下骨中上調(diào)。IgSF11缺乏不僅可以抑制OA軟骨下骨的變化，還能阻止軟骨破壞。OA軟骨下骨中表達(dá)IgSF11的細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)參與破骨細(xì)胞成熟和骨吸收，并與關(guān)鍵破骨細(xì)胞分化因子核因子κ-B（RANK）受體激活劑共定位。作者的發(fā)現(xiàn)為OA的治療提供了新的策略。

實(shí)驗(yàn)方法：

       WB、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色、qRT?PCR

參考文獻(xiàn)：

       Kim GM, Kim J, Lee J-Y, Park M-C, Lee SY. IgSF11 deficiency alleviates osteoarthritis in mice by suppressing early subchondral bone changes. Experimental & Molecular Medicine. 2023. doi: 10.1038/s12276-023-01126-6.