m6A修飾環(huán)狀RNA驅(qū)動(dòng)的正反饋回路促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移

         結(jié)直腸癌（CRC）是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別居所有惡性腫瘤的第3位和第2位。腫瘤轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。臨床上約有45-60%的CRC患者存在肝轉(zhuǎn)移，超過(guò)90%的肝轉(zhuǎn)移灶在初診時(shí)無(wú)法切除。未行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的中位生存時(shí)間僅為6.9個(gè)月，5年生存率低于5%。因此，破譯結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，預(yù)防和干預(yù)轉(zhuǎn)移，提高患者生存率具有重要的臨床意義。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類(lèi)特殊的內(nèi)源性RNA分子，具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由剪接體催化的反向剪接事件產(chǎn)生，一個(gè)基因位點(diǎn)可以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)circRNA。高通量測(cè)序和計(jì)算機(jī)模擬方法已經(jīng)確定circRNA高度保守，并以疾病、組織或細(xì)胞特異性模式廣泛表達(dá)。circRNA越來(lái)越多地參與各種人類(lèi)疾病的發(fā)生和發(fā)展，一些circRNA被確定為預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展和預(yù)后的生物標(biāo)志物。有趣的是，最近的一些證據(jù)表明，circRNA可以被翻譯成功能性肽。例如，circRNA編碼的截短蛋白如E-Cad-254aa和ARHGAP35-1289aa已被報(bào)道分別在膠質(zhì)瘤和肝細(xì)胞癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于circRNA的頭尾形狀，其編碼蛋白質(zhì)的方式不依賴(lài)帽，由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）或N6-甲基腺苷（m6A）修飾驅(qū)動(dòng)。m6A是真核生物RNA中最豐富的內(nèi)部修飾，它是動(dòng)態(tài)可逆的。到目前為止，只有少數(shù)隱藏在circRNA中的內(nèi)源性小蛋白被表征，絕大多數(shù)的功能相關(guān)性還有待發(fā)現(xiàn)。該研究發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF：37.3。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究結(jié)果：

1. Circ-YAP與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)

         為了鑒定在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中具有翻譯活性的關(guān)鍵circRNA，研究者分析了circRNA微陣列和核糖體新生鏈復(fù)合體結(jié)合RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。接下來(lái)，檢測(cè)了circ-YAP在新鮮冷凍組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常組織相比，circ-YAP在CRC組織中輕度升高，而在肝轉(zhuǎn)移病例中顯著過(guò)表達(dá)（圖1A）。同樣，在高轉(zhuǎn)移潛能的CRC細(xì)胞系中也觀察到高circ-YAP（圖1B）。序列分析顯示，circ-YAP來(lái)源于YAP前體mRNA第2、7外顯子的反剪接，成熟全長(zhǎng)為842 bp（圖1C）。在正常和CRC細(xì)胞中，Circ-YAP對(duì)RNAse R消化均有抗性（圖1D），而其線(xiàn)性異構(gòu)體則無(wú)抗性(圖1E)。此外，Circ-YAP的半衰期超過(guò)24h（圖1E）。qRT-PCR和FISH檢測(cè)結(jié)果顯示，circ-YAP主要定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖1F）。為了進(jìn)一步探索circ-YAP的臨床相關(guān)性，研究者收集了石蠟包埋組織，采用ISH檢測(cè)circ-YAP的表達(dá)。與預(yù)期一致，circ-YAP在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組織中顯著上調(diào)（圖1G，H），曲線(xiàn)下面積（AUC）值為0.8433（圖1I）。更重要的是，高circ-YAP患者的生存時(shí)間比低circ-YAP患者短（圖1J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，circ-YAP是一個(gè)真正的circRNA，可能用作CRC肝轉(zhuǎn)移的一個(gè)有前景的指標(biāo)和預(yù)后標(biāo)志物。

圖1 circ-YAP在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組織中的鑒定

2. 敲低circ-YAP可減輕結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移負(fù)荷

         為了研究circ-YAP的生物學(xué)功能，研究者使用CRISPR/Cas13d技術(shù)沉默circ-YAP。如圖2A所示，設(shè)計(jì)的3種gRNA均能有效敲低circ-YAP，但不影響YAP mRNA的表達(dá)。劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)顯示，沉默circ-YAP顯著抑制LoVo細(xì)胞的遷移（圖2B，C）和侵襲（圖2D，E）。接下來(lái)，研究者在circ-YAP低表達(dá)的CRC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circ-YAP（圖2F），結(jié)果顯示，circ-YAP過(guò)表達(dá)后細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)（圖2G，H）。通過(guò)在NOD/SCID小鼠的腸壁內(nèi)注射TC71 PDX細(xì)胞建立自發(fā)性結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移PDX模型（圖2I）。10周后，對(duì)照組50%的小鼠發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移，而circ-YAP沉默組只有6.7%的小鼠發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移（圖2J，K）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明circ-YAP在CRC細(xì)胞侵襲性和肝轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。

圖2 沉默circ-YAP可減輕結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移負(fù)荷

3. Circ-YAP編碼YAP蛋白異構(gòu)體YAP-220aa

         通過(guò)序列比對(duì)，研究者發(fā)現(xiàn)circ-YAP包含一個(gè)潛在的跨越ORF連接位點(diǎn)，編碼220-aa蛋白（圖3A，B）。為了驗(yàn)證circ-YAP是可翻譯的，研究者在circ-YAP過(guò)表達(dá)載體中添加Flag標(biāo)簽；其中，circ-YAP的連接位點(diǎn)被移動(dòng)到ORF的終止密碼子，Flag序列被一分為二，位于circ-YAP的兩側(cè)（圖3C）。轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，flag tag抗體檢測(cè)到約26 kDa的條帶（圖3D）?？捡R斯亮藍(lán)染色顯示，過(guò)表達(dá)circ-YAP后，這一條帶更加明顯，隨后，通過(guò)質(zhì)譜分析驗(yàn)證了YAP-220aa的獨(dú)特氨基酸序列（圖3E）。接下來(lái)，研究者制備了特異性靶向YAP-220aa的兔多克隆抗體，并證實(shí)其能有效檢測(cè)內(nèi)源性YAP-220aa蛋白（圖3F）。鑒于circRNA的翻譯是由IRES或m6A修飾驅(qū)動(dòng)的，研究者首先評(píng)估了IRES對(duì)circ-YAP的翻譯活性。值得注意的是，在翻譯起始位點(diǎn)的近端發(fā)現(xiàn)了一個(gè)高度保守的m6A位點(diǎn)“GGACA”（圖3B）。腺嘌呤突變?yōu)榘奏ず螅▓D3C），YAP-220aa蛋白幾乎無(wú)法被抗flag抗體檢測(cè)到（圖3D），這意味著m6A對(duì)circ-YAP翻譯至關(guān)重要。YAP-220aa主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖3G），并且在高轉(zhuǎn)移CRC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)（圖3H）。同樣，沉默METTL3顯著降低了內(nèi)源性YAP-220aa的表達(dá)（圖3I），并且與低轉(zhuǎn)移的CRC細(xì)胞相比，高轉(zhuǎn)移的CRC細(xì)胞中circ-YAP的m6A富集更多（圖3J）。功能上，過(guò)表達(dá)circ-YAP增強(qiáng)了HT29和SW480細(xì)胞的遷移和侵襲，這些作用被m6A突變阻斷（圖3K，L）。此外，實(shí)驗(yàn)肝轉(zhuǎn)移模型顯示，野生型circ-YAP增加了CRC細(xì)胞在體內(nèi)的肝轉(zhuǎn)移（圖3M），而m6A突變型circ-YAP沒(méi)有增加（圖3M）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明circ-YAP的功能是通過(guò)翻譯成一個(gè)新的YAP蛋白亞型，這是由m6A修飾介導(dǎo)的。

圖3 Circ-YAP編碼由m6A介導(dǎo)的YAP-220aa

4. 翻譯circ-YAP需要m6A閱讀器YTHDF3

         研究者想知道哪些m6A閱讀蛋白參與了circ-YAP翻譯過(guò)程。如圖4A所示，敲低YTHDF3，而不是YTHDF1/2，顯著阻斷了由circ-YAP過(guò)表達(dá)引起的YAP-220aa水平升高（圖4A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證YTHDF3對(duì)circ-YAP翻譯的影響，研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了YTHDF3敲除的CRC細(xì)胞株。結(jié)果表明，在YTHDF3?/?LoVo和SW620細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到p-circ-YAP-Flag的翻譯產(chǎn)物（圖4B，C）。相反，YTHDF3過(guò)表達(dá)細(xì)胞中YAP-220aa的表達(dá)顯著增加，但這種作用在刪除活性YTH結(jié)構(gòu)域后消失（圖4D）。RIP和RNA pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了circ-YAP和YTHDF3之間的相互作用（圖4E，F）。此外，體外合成circ-YAP并與GST-tag YTHDF3蛋白孵育，結(jié)果顯示circ-YAP直接結(jié)合YTHDF3（圖4G）?？紤]到YTHDF3介導(dǎo)的翻譯調(diào)節(jié)需要非經(jīng)典eIF4G2，研究者進(jìn)行了Co-IP實(shí)驗(yàn)，并證實(shí)YTHDF3和eIF4G2在SW620和LoVo細(xì)胞中形成內(nèi)源性復(fù)合體（圖4H）。正如預(yù)期，沉默eIF4G2顯著降低了YAP-220aa蛋白水平（圖4I）。RNA pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，eIF4G2和eIF4A/B被circ-YAP富集，而這些相互作用被YTHDF3敲除消除（圖4J，K），表明circ-YAP通過(guò)YTHDF3招募eIF4G2翻譯起始復(fù)合物。功能上，敲除YTHDF3或沉默eIF4G2后，circ-YAP引起的細(xì)胞侵襲增強(qiáng)被明顯抵消（圖4L，M）。

圖4 YTHDF3招募eIF4G2復(fù)合體來(lái)驅(qū)動(dòng)circ-YAP翻譯

5. YAP-220aa與LATS1相互作用并增加YAP的核轉(zhuǎn)位

         通過(guò)分析YAP-220aa蛋白序列，研究者發(fā)現(xiàn)YAP-220aa包含了YAP的WW1/2結(jié)構(gòu)域，這是與LATS1相互作用所必需的，隨后YAP被14-3-3磷酸化并被保留在細(xì)胞質(zhì)中。因此，研究者推測(cè)YAP-220aa可能與LATS1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而阻斷YAP磷酸化。正如預(yù)期的那樣，在轉(zhuǎn)染p-circ-YAP-Flag載體的HEK293T細(xì)胞中，Flag-tag抗體大量免疫沉淀LATS1，然而，當(dāng)WW1/2結(jié)構(gòu)域被刪除后，上述現(xiàn)象消失（圖5A）。此外，在LoVo和SW620細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了YAP-220aa和LATS1之間的內(nèi)源性結(jié)合（圖5B，C）。敲低circ-YAP顯著增加了YAP和LATS1, 14-3-3之間的相互作用（圖5D，E）。此外，在circ-YAP沉默的CRC細(xì)胞中，YAP-220aa減少，而YAP磷酸化增加，然而，這些作用被野生型circ-YAP過(guò)表達(dá)消除，但沒(méi)有被m6A突變的circ-YAP過(guò)表達(dá)消除（圖5F，G）。增強(qiáng)circ-YAP的表達(dá)導(dǎo)致更多的YAP從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，m6A突變后這種現(xiàn)象消失（圖5H，I）。在circ-YAP沉默的CRC細(xì)胞中，YAP熒光素酶報(bào)告活性及其下游促轉(zhuǎn)移基因水平顯著降低（圖5J，K）。YAP敲低或使用YAP的藥物抑制劑維替泊芬治療后，circ-YAP誘導(dǎo)的侵襲和肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)被顯著消除（圖5L-N）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，circ-YAP編碼的YAP-220aa通過(guò)與LATS1相互作用激活YAP從而促進(jìn)CRC的侵襲性和肝轉(zhuǎn)移。

圖5 YAP-220aa增加YAP活性

6. YAP/TEAD復(fù)合體反轉(zhuǎn)錄激活circ-YAP

         YAP是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過(guò)與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。有趣的是，YAP敲低或維替泊芬處理顯著降低了HEK293T和CRC細(xì)胞中的circ-YAP表達(dá)（圖6A）。值得注意的是，新生的circ-YAP也受到YAP和維替泊芬的影響（圖6B），這表明YAP在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)circ-YAP表達(dá)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，一些circRNA具有獨(dú)立于其線(xiàn)性親本的自身啟動(dòng)子。將circYAP的啟動(dòng)子片段插入pGL3-basic載體中，熒光素酶結(jié)果顯示YAP在circ-YAP起始位點(diǎn)上游-974~-374處增加了circ-YAP的轉(zhuǎn)錄活性（圖6C）。通過(guò)JASPAR工具進(jìn)行序列分析，在上述區(qū)域發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)TEAD結(jié)合基序（TB1，-886~-877，TAAATACTAT；TB2，-406~-397，CATATTCTTT）（圖6D）。如圖6E、F所示，TB1或TB2的突變顯著降低了circ-YAP的啟動(dòng)子活性，但當(dāng)同時(shí)突變時(shí)，YAP-5SA引起的啟動(dòng)子活性增強(qiáng)被完全抵消。此外，YAP-5SA增加了TEAD2沉默細(xì)胞中circ-YAP的表達(dá)，但并未增加TEAD1/3/4沉默細(xì)胞中circ-YAP的表達(dá)（圖6G，H），表明TEAD1/3/4負(fù)責(zé)yap介導(dǎo)的circ-YAP調(diào)控。此外，ChIP檢測(cè)的結(jié)果表明，YAP與TB1和TB2結(jié)合（圖6I），同時(shí)募集Pol II和隨后的磷酸化（圖6J，K），這是從起始復(fù)合物釋放Pol II和起始延伸所需的修飾。此外，ChIP-re-ChIP數(shù)據(jù)表明，YAP/TEAD1復(fù)合物在circ-YAP啟動(dòng)子的TB1和TB2處富集（圖6L，M），這也通過(guò)使用生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行的DNA下拉實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證（圖6N）。以上結(jié)果表明，circ-YAP被YAP轉(zhuǎn)錄激活，從而形成促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的正反饋環(huán)路。

圖6 Circ-YAP是YAP激活的轉(zhuǎn)錄

7. circ-YAP/YAP-220aa/YAP調(diào)控軸的臨床驗(yàn)證

         最后，研究者檢測(cè)了YAP靶基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，circ-YAP表達(dá)與促轉(zhuǎn)移基因CYR61、CTGF、TWIST1和FOXM1呈正相關(guān)（圖7A-D）。此外，免疫染色結(jié)果顯示，92.5%的CRC病例具有相同的circ-YAP和YAP-220aa的表達(dá)趨勢(shì)，只有7.5%的病例具有不一致的表達(dá)趨勢(shì)（圖7E，F）。并且高circ-YAP與YAP的核聚集呈強(qiáng)正相關(guān)（圖7E，G）。YAP-220aa在有肝轉(zhuǎn)移的CRC中表達(dá)高于無(wú)肝轉(zhuǎn)移的CRC（圖7H），其AUC值為0.8597（圖7I），提示YAP-220aa可能作為預(yù)測(cè)CRC肝轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。重要的是，高circ-YAP和yap-220aa的患者比低circ-YAP和yap-220aa的患者生存時(shí)間更短（圖7J），表明兩者聯(lián)合比單獨(dú)circ-YAP具有更好的預(yù)后價(jià)值。

圖7 circ-YAP/YAP-220aa/YAP調(diào)控軸在臨床樣本中的驗(yàn)證

結(jié)論：

         綜上所述，該研究揭示了circRNA編碼的蛋白和Hippo/YAP信號(hào)通路之間迄今未被識(shí)別的偶聯(lián)，對(duì)CRC肝轉(zhuǎn)移的治療具有指導(dǎo)意義。

實(shí)驗(yàn)方法：

         定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），熒光原位雜交（FISH），原位雜交（ISH），免疫組織化學(xué)（IHC），細(xì)胞轉(zhuǎn)染，傷口愈合實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)，CCK-8檢測(cè)，小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立，蛋白質(zhì)印跡，免疫共沉淀（Co-IP），免疫熒光（IF），RNA免疫沉淀（RIP），甲基化免疫沉淀（meRIP），RNA pull-down檢測(cè)，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP），DNA pull-down檢測(cè)

參考文獻(xiàn)：

         Zeng K, Peng J, Xing Y, Zhang L, Zeng P, Li W, Zhang W, Pan Z, Zhou C, Lin J. A positive feedback circuit driven by m6A-modified circular RNA facilitates colorectal cancer liver metastasis. Mol Cancer. 2023 Dec 13;22(1):202. doi: 10.1186/s12943-023-01848-1.