睪丸特異性表達lncRNA—THOR在腫瘤中的功能研究
睪丸特異性表達lncRNA—THOR在腫瘤中的功能研究
大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果已經(jīng)廣泛展示了擁有不同保守性、系譜表達和腫瘤特異性的lncRNAs的種類。有研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的超級保守的lncRNA—THOR(ENSG00000226856)，其在睪丸以及很多的腫瘤中廣泛表達，并以“Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA”為題，發(fā)表在Cell（IF=30.41）上。研究發(fā)現(xiàn)在多種細胞系和動物模型中敲除或過表達THOR，能影響細胞或腫瘤的生長。作者同時發(fā)現(xiàn)THOR和IGF2BP1存在保守的互作關(guān)系，THOR促進IGF2BP1 mRNA的穩(wěn)定性。敲除THOR使石斑魚產(chǎn)生生殖缺陷，并抗黑色素瘤形成。相似地，在石斑魚中過表達人的THOR基因，能加速黑色素瘤的形成。THOR代表了一類新的具有功能的重要腫瘤lncRNAs，這類lncRNAs的結(jié)構(gòu)和功能是經(jīng)過正向的進化篩選而形成。
文章亮點：作者發(fā)現(xiàn)了一種新的超級保守的lncRNA—THOR，其在睪丸中特異性表達，體外和體內(nèi)實驗研究了其在腫瘤發(fā)生過程中的重要作用。
研究路線：
研究結(jié)果：
圖1 THOR是一個保守的睪丸lncRNA。A.基因間區(qū)堿基轉(zhuǎn)錄本保守水平（X軸）和最保守的200bp滑動窗口中平均保守性（Y軸）的散點圖。綠色的點是指在200bp的轉(zhuǎn)錄本窗口中達到超級保守區(qū)域的標準的轉(zhuǎn)錄本。B.在圖A中鑒定的超級保守的lncRNAs的保守的堿基比例（X軸上部，綠色）和在RNA-Seq樣本中表達（X軸下部，藍色）C.RNA-Seq數(shù)據(jù)集GTEx正常組織中THOR的FPKM表達值。D.THOR在基因組上的展示，以及其在小鼠和石斑魚中的保守同源物。
圖2 THOR呈現(xiàn)睪丸特異性表達。A.qRT-PCR檢測成年人正常組織中THOR的mRNA表達水平。B.人睪丸的H&E斑放大400倍（右）；人睪丸中THOR的RNA-ISH（左）。C.qRT-PCR檢測成年鼠組織（左）和胚胎（右）中THOR的表達水平。D. qRT-PCR檢測石斑魚組織（左）和胚胎（右）中THOR的表達水平。
圖3 THOR在腫瘤和可能的腫瘤發(fā)生組織中表達。A.來源于GTEx和TCGA數(shù)據(jù)庫的TCGA腫瘤和正常組織樣本中THOR的表達。B.CCLE細胞系中THOR的表達。C.TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌（LUAD）和肺鱗狀細胞癌（LUSC）樣本及其相對應的正常組織樣本中THOR的表達。D. qRT-PCR驗證LUAD中的一個獨立組織以及黑色素瘤組織中THOR的表達。E.兩個皮膚黑色素瘤（SKCM）和兩個非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系中THOR的表達水平。F.2個獨立的THOR siRNAs處理之后，NCI-H1299細胞的細胞增殖情況。G. 2個獨立的THOR ASOs處理之后，NCI-H1299細胞的細胞增殖情況。H.轉(zhuǎn)染非靶向siRNA（si-NT）或兩個siRNAs（siTHOR-A，siTHOR-B）后H1299細胞的生長情況。左圖：克隆的數(shù)目；右圖：代表性的存活克隆和單個克隆的圖像。I.LacZ和THOR分別過表達的情況下，CRISPR-Cas9介導的THOR敲除后的NCI-H1299細胞與對照的細胞增殖情況。J.THOR敲除后的NCI-H1299細胞系移植實驗顯示：與對照樣本相比，腫瘤生長減慢。K.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染THOR過表達載體或LacZ對照載體的NCI-H1437細胞的細胞增殖情況。H. LacZ或THOR過表達的H1437細胞的生長情況。M.THOR過表達的NCI-H1437細胞系移植實驗顯示：與對照樣本相比，腫瘤生長加快。
圖4 THOR和IGF2BP1保守的互作關(guān)系。A.4種不同的實驗條件下RNA pull-down結(jié)果：人H1299細胞溶解物中加入石斑魚THOR標為綠色；人H1299細胞溶解物中加入人THOR標為藍色；石斑魚胚胎溶解物中加入石斑魚THOR標為黃色；石斑魚胚胎溶解物加入人THOR標為紅色。C.H1299細胞中IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、STAU1、YBX1、HUR和IgG RIP后，再qRT-PCR驗證。D.體外RNA-蛋白結(jié)合實驗。純化的myc-標記的蛋白中加入轉(zhuǎn)錄后的THOR，qRT-PCR檢測顯示抗myc pull-down作用。E.人THOR、antisense-THOR（AS）及不同的缺失構(gòu)建的示意圖展示（左圖）。片段大小由PCR確認（右圖，上）；BRU標記的RNA片段的pull-down檢測每一片段結(jié)合到IGF2BP1上的情況（右圖，下）。F.石斑魚THOR構(gòu)建的示意圖展示（左圖）。片段大小由PCR確認（右圖，上）；BRU標記的RNA片段的pull-down檢測每一片段結(jié)合到石斑魚igf2bp1上的情況（右圖，下）。
圖5 在H1299細胞中敲除THOR、IGF2BP1或HUR后，顯著差異表達的基因熱圖。B. 敲除THOR、IGF2BP1或HUR后，細胞中顯著差異表達的基因的交集情況韋恩圖展示。
圖6 THOR調(diào)控石斑魚黑色素瘤的形成。A.THOR敲除的石斑魚模型的構(gòu)建流程圖。B.來源于野生型的石斑魚或THOR敲除的石斑魚的受精胚胎的比率。C.野生型雌性石斑魚和THOR敲除的雄性石斑魚交配產(chǎn)生的受精胚胎以及THOR敲除的雌性石斑魚和野生型雄性石斑魚交配產(chǎn)生的受精胚胎的比率。D.睪丸狀體細胞及6種睪丸狀生殖細胞中THOR的表達水平。E.qRT-PCR檢測石斑魚胚胎中12種典型的IGF2BP1靶基因同源基因的表達情況。F.THOR敲除或野生型石斑魚注射NRAS 61K（可使石斑魚黑色素瘤的形成可視化）后的KM曲線圖。G.THOR過表達的黑色素瘤石斑魚模型傳代示意圖。H.注射p53-/-，再共注射促進THOR的啟動子或促進對照的啟動子的石斑魚的KM曲線圖。I.注射mCherry或THOR，同時注射促進NRAS 61K的啟動子后，黑色素瘤占體表面積的百分數(shù)。J.共注射促進THOR的啟動子或促進對照mCherry的啟動子和p53-/-后，NRAS 61K促進石斑魚黑色素瘤形成的樣例。
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