睪丸特異性表達(dá)lncRNA—THOR在腫瘤中的功能研究
睪丸特異性表達(dá)lncRNA—THOR在腫瘤中的功能研究
大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果已經(jīng)廣泛展示了擁有不同保守性、系譜表達(dá)和腫瘤特異性的lncRNAs的種類。有研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的超級(jí)保守的lncRNA—THOR(ENSG00000226856)，其在睪丸以及很多的腫瘤中廣泛表達(dá)，并以“Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA”為題，發(fā)表在Cell（IF=30.41）上。研究發(fā)現(xiàn)在多種細(xì)胞系和動(dòng)物模型中敲除或過(guò)表達(dá)THOR，能影響細(xì)胞或腫瘤的生長(zhǎng)。作者同時(shí)發(fā)現(xiàn)THOR和IGF2BP1存在保守的互作關(guān)系，THOR促進(jìn)IGF2BP1 mRNA的穩(wěn)定性。敲除THOR使石斑魚產(chǎn)生生殖缺陷，并抗黑色素瘤形成。相似地，在石斑魚中過(guò)表達(dá)人的THOR基因，能加速黑色素瘤的形成。THOR代表了一類新的具有功能的重要腫瘤lncRNAs，這類lncRNAs的結(jié)構(gòu)和功能是經(jīng)過(guò)正向的進(jìn)化篩選而形成。
文章亮點(diǎn)：作者發(fā)現(xiàn)了一種新的超級(jí)保守的lncRNA—THOR，其在睪丸中特異性表達(dá)，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了其在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的重要作用。
研究路線：
研究結(jié)果：
圖1 THOR是一個(gè)保守的睪丸lncRNA。A.基因間區(qū)堿基轉(zhuǎn)錄本保守水平（X軸）和最保守的200bp滑動(dòng)窗口中平均保守性（Y軸）的散點(diǎn)圖。綠色的點(diǎn)是指在200bp的轉(zhuǎn)錄本窗口中達(dá)到超級(jí)保守區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄本。B.在圖A中鑒定的超級(jí)保守的lncRNAs的保守的堿基比例（X軸上部，綠色）和在RNA-Seq樣本中表達(dá)（X軸下部，藍(lán)色）C.RNA-Seq數(shù)據(jù)集GTEx正常組織中THOR的FPKM表達(dá)值。D.THOR在基因組上的展示，以及其在小鼠和石斑魚中的保守同源物。
圖2 THOR呈現(xiàn)睪丸特異性表達(dá)。A.qRT-PCR檢測(cè)成年人正常組織中THOR的mRNA表達(dá)水平。B.人睪丸的H&E斑放大400倍（右）；人睪丸中THOR的RNA-ISH（左）。C.qRT-PCR檢測(cè)成年鼠組織（左）和胚胎（右）中THOR的表達(dá)水平。D. qRT-PCR檢測(cè)石斑魚組織（左）和胚胎（右）中THOR的表達(dá)水平。
圖3 THOR在腫瘤和可能的腫瘤發(fā)生組織中表達(dá)。A.來(lái)源于GTEx和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的TCGA腫瘤和正常組織樣本中THOR的表達(dá)。B.CCLE細(xì)胞系中THOR的表達(dá)。C.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌（LUAD）和肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）樣本及其相對(duì)應(yīng)的正常組織樣本中THOR的表達(dá)。D. qRT-PCR驗(yàn)證LUAD中的一個(gè)獨(dú)立組織以及黑色素瘤組織中THOR的表達(dá)。E.兩個(gè)皮膚黑色素瘤（SKCM）和兩個(gè)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系中THOR的表達(dá)水平。F.2個(gè)獨(dú)立的THOR siRNAs處理之后，NCI-H1299細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況。G. 2個(gè)獨(dú)立的THOR ASOs處理之后，NCI-H1299細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況。H.轉(zhuǎn)染非靶向siRNA（si-NT）或兩個(gè)siRNAs（siTHOR-A，siTHOR-B）后H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。左圖：克隆的數(shù)目；右圖：代表性的存活克隆和單個(gè)克隆的圖像。I.LacZ和THOR分別過(guò)表達(dá)的情況下，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的THOR敲除后的NCI-H1299細(xì)胞與對(duì)照的細(xì)胞增殖情況。J.THOR敲除后的NCI-H1299細(xì)胞系移植實(shí)驗(yàn)顯示：與對(duì)照樣本相比，腫瘤生長(zhǎng)減慢。K.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染THOR過(guò)表達(dá)載體或LacZ對(duì)照載體的NCI-H1437細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況。H. LacZ或THOR過(guò)表達(dá)的H1437細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。M.THOR過(guò)表達(dá)的NCI-H1437細(xì)胞系移植實(shí)驗(yàn)顯示：與對(duì)照樣本相比，腫瘤生長(zhǎng)加快。
圖4 THOR和IGF2BP1保守的互作關(guān)系。A.4種不同的實(shí)驗(yàn)條件下RNA pull-down結(jié)果：人H1299細(xì)胞溶解物中加入石斑魚THOR標(biāo)為綠色；人H1299細(xì)胞溶解物中加入人THOR標(biāo)為藍(lán)色；石斑魚胚胎溶解物中加入石斑魚THOR標(biāo)為黃色；石斑魚胚胎溶解物加入人THOR標(biāo)為紅色。C.H1299細(xì)胞中IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、STAU1、YBX1、HUR和IgG RIP后，再qRT-PCR驗(yàn)證。D.體外RNA-蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)。純化的myc-標(biāo)記的蛋白中加入轉(zhuǎn)錄后的THOR，qRT-PCR檢測(cè)顯示抗myc pull-down作用。E.人THOR、antisense-THOR（AS）及不同的缺失構(gòu)建的示意圖展示（左圖）。片段大小由PCR確認(rèn)（右圖，上）；BRU標(biāo)記的RNA片段的pull-down檢測(cè)每一片段結(jié)合到IGF2BP1上的情況（右圖，下）。F.石斑魚THOR構(gòu)建的示意圖展示（左圖）。片段大小由PCR確認(rèn)（右圖，上）；BRU標(biāo)記的RNA片段的pull-down檢測(cè)每一片段結(jié)合到石斑魚igf2bp1上的情況（右圖，下）。
圖5 在H1299細(xì)胞中敲除THOR、IGF2BP1或HUR后，顯著差異表達(dá)的基因熱圖。B. 敲除THOR、IGF2BP1或HUR后，細(xì)胞中顯著差異表達(dá)的基因的交集情況韋恩圖展示。
圖6 THOR調(diào)控石斑魚黑色素瘤的形成。A.THOR敲除的石斑魚模型的構(gòu)建流程圖。B.來(lái)源于野生型的石斑魚或THOR敲除的石斑魚的受精胚胎的比率。C.野生型雌性石斑魚和THOR敲除的雄性石斑魚交配產(chǎn)生的受精胚胎以及THOR敲除的雌性石斑魚和野生型雄性石斑魚交配產(chǎn)生的受精胚胎的比率。D.睪丸狀體細(xì)胞及6種睪丸狀生殖細(xì)胞中THOR的表達(dá)水平。E.qRT-PCR檢測(cè)石斑魚胚胎中12種典型的IGF2BP1靶基因同源基因的表達(dá)情況。F.THOR敲除或野生型石斑魚注射NRAS 61K（可使石斑魚黑色素瘤的形成可視化）后的KM曲線圖。G.THOR過(guò)表達(dá)的黑色素瘤石斑魚模型傳代示意圖。H.注射p53-/-，再共注射促進(jìn)THOR的啟動(dòng)子或促進(jìn)對(duì)照的啟動(dòng)子的石斑魚的KM曲線圖。I.注射mCherry或THOR，同時(shí)注射促進(jìn)NRAS 61K的啟動(dòng)子后，黑色素瘤占體表面積的百分?jǐn)?shù)。J.共注射促進(jìn)THOR的啟動(dòng)子或促進(jìn)對(duì)照mCherry的啟動(dòng)子和p53-/-后，NRAS 61K促進(jìn)石斑魚黑色素瘤形成的樣例。
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